基于ZnO納米棒液相自組裝固定血紅蛋白及其直接電化學傳感器

張 琦，段國萍，郭小玉，楊海峰

（資源化學教育部重點實驗室，上海師范大學化學系，上海200234）

基于ZnO納米棒液相自組裝固定血紅蛋白及其直接電化學傳感器

張 琦，段國萍，郭小玉*，楊海峰*

（資源化學教育部重點實驗室，上海師范大學化學系，上海200234）

自組裝方法制備納米生物傳感器時，常利用聚電解質(zhì)(如PDDA,poly(diallyl-dimethyl ammonium chloride))與納米材料和酶的相互作用。但是聚電解質(zhì)易導致納米材料團聚，或損害酶的活性，且操作過程較復雜，制備重現(xiàn)性不理想。該工作，利用納米ZnO與血紅蛋白（Hb）等電點差異，直接在納米材料分散液進行酶混合組裝，然后再通過自組裝，固定到玻碳電極表面，從而實現(xiàn)了Hb與電極間的直接電子傳遞。利用紫外吸收光譜（UV-vis）、透射電子顯微鏡（TEM）及循環(huán)伏安等方法對制備過程進行了表征。修飾電極測定H2O2溶液的線性范圍是1．06×10-6～7．82×10-3mol/L，檢測限是8．86×10-7mol/L（S/N=3）。相同實驗條件下，制備電極對相同濃度H2O2的響應電流的相對標準偏差（R．S．D）在1．9%左右，表明該方法制備的生物傳感器制備過程簡單、有好的穩(wěn)定性和重現(xiàn)性。

納米ZnO;血紅蛋白;自組裝;直接電子傳遞

0 引言

H2O2是生物體內(nèi)許多氧化酶反應的副產(chǎn)物，因此制備生物傳感器[1-5]對其含量進行測定在生物、臨床、食品和環(huán)境分析中具有重要意義[6]。檢測H2O2有很多種方法，電化學法相對比較好。但是，H2O2的直接電化學檢測需要相對較高的超電位[7]。納米ZnO作為一種半導體材料，有很寬的能帶隙，它有較好的生物親和性，比表面積大，良好的生物相容性和高的電子傳遞特性[8]且等電點比較高，適合用來固定生物分子，尤其是低等電點的蛋白酶，比如血紅蛋白（Hb）。

考慮到利用層層自組裝制備基于納米材料的生物傳感器的研究中[9]，遇到的主要技術問題是使用的聚電解質(zhì)如PDDA（poly(diallyldimethyl ammonium chloride)）易導致納米材料發(fā)生團聚，或可能損害酶的活性，在電極表面的固定過程比較復雜，傳感器的重現(xiàn)性不理想。該文開展一種基于生物活性分子與納米材料等電點不同，先液相組裝后再構(gòu)建修飾電極：即納米氧化鋅分散液和血紅蛋白混合組裝后，再組裝到玻碳電極（GCE）上。研究表明，這種簡單易行的制備方法很好的實現(xiàn)了Hb與電極間的直接電子傳遞,而且對H2O2響應迅速,傳感器的制備重現(xiàn)性大大提高。

1 實驗部分

1.1 化學試劑

血紅蛋白（Hb，來自牛血清，上海生化試劑公司）、納米ZnO（自制）、H2O2（30%V/V水溶液）、Na2HPO4、KH2PO4、KCl、H3PO4、KCl、NaOH均為分析純試劑，HAuCl4、檸檬酸三鈉（國藥集團化學試劑有限公司），實驗所用水為超純水（＞18MΩ·cm）。

1.2 實驗儀器

循環(huán)伏安（CV）測量在CHI650電化學工作站（上海辰華公司）上進行，并采用常規(guī)的三電極體系。其中，玻碳電極或經(jīng)過修飾的玻碳電極作為工作電極，鉑片電極作對電極，飽和甘汞電極（SCE）用作參比電極；紫外可見（UV-vis）光譜實驗采用UV-8500型紫外可見分光光度計 （上海天美科學儀器有限公司）；PHS-3C精密pH計（上海雷磁儀器廠）；SK2200H超聲儀 （上?？茖С晝x器有限公司）；透射電子顯微譜（TEM譜）由JEOL-JEM200CX型透射電鏡得到。

1.3 納米ZnO分散液的制備

納米ZnO是根據(jù)文獻[10]運用種子助長的化學反應法制備的。具體的實驗制備方法是：稱取1．335 g硝酸鋅溶解在100mL的超純水中，同時，稱取0．63 g二亞乙基三胺溶解在100mL的超純水中，攪拌30min后，將這兩種溶液混合并加熱，在500mL的烤箱中在95℃的條件下加熱3 h。最后將得到的產(chǎn)品冷卻、蒸餾水洗滌并晾干。這樣就制得了粒徑大約在10～20 nm左右的棒狀的納米ZnO。 取前面已制備好的納米ZnO 25 mg放入盛有25mL超純水的燒杯中，攪拌4 h使之充分溶解，然后過濾得1mg/mL的納米ZnO分散液。

1.4 修飾電極的制備

玻碳電極先用細的金相砂紙打磨干凈，然后用二次蒸餾水超聲，再依次用0．3，0．05μm Al2O3粉末進行拋光。拋光后電極依次用二次蒸餾水、乙醇、和二次蒸餾水進行超聲清洗。將上面制備好的1 mg/mL的納米ZnO分散液與1．34×10-4mol/L的血紅蛋白（Hb，pH7．0）溶液以體積比為1∶1的比例混合。然后將處理干凈的玻碳電極浸泡在混合溶液中放置于冰箱 （4℃）中進行自組裝20 h，制備ZnONRs-Hb/GCE修飾電極。作為對比，相同條件下，還制備了ZnONPs/GCE修飾電極和裸玻碳電極。

1.5 測量方法

取10 mL 0．067 mol/L的磷酸鹽緩沖溶液（PBS，pH7．0）于反應池中，連接三電極系統(tǒng)，鉑電極為對電極，飽和的甘汞電極為參比電極，修飾電極為工作電極。CV實驗在靜止溶液中操作。計時電流（CA）實驗在攪拌溶液中操作，待基線電流穩(wěn)定后，加入一定量的H2O2，記錄響應電流值。

2 結(jié)果與討論

2.1 TEM表征

圖1是納米ZnO分散液和納米ZnO-Hb溶液的透射電鏡圖。從圖1（a）中可以發(fā)現(xiàn)所制備的納米ZnO是棒狀的，粒徑在10～20 nm左右，當ZnO分散液和Hb溶液以體積比1∶1混合后，Hb密集地包埋在棒狀的納米ZnO中，如圖1（b）。

2.2 紫外可見吸收光譜

圖1 納米ZnO（a）和納米ZnO-Hb（b）的透射電鏡圖Fig.1 TEM imagesof ZnONRs（a）and ZnONRs-Hb（b）

圖2 不同溶液的紫外可見光譜圖Fig.2 UV-visabsorption spectra of ZnONRs（A）、Hb（B）and ZnONRs-Hb（C）

圖3 （A）不同修飾電極的循環(huán)伏安圖；（B）ZnONRs-Hb/GCE修飾電極在磷酸緩沖溶液（pH7.0）中連掃50圈Fig.3 （A）Cyclic voltammograms（CVs）ofbare GCE（a）ZnONRs/GCE（b）ZnONRs-Hb/GCE（c）in PBS（pH7.0）.（B）Cyclic voltammograms（CVs）of ZnONRs-Hb/GCE in pH7.0 PBSsolutionwith 50 circles. Scan rateat200mV/s

圖2是不同溶液的紫外可見光譜，棒狀的納米ZnO分散液在348 nm左右有最大吸收峰，如圖2（A）。從圖2（B）中，可以看到，血紅蛋白（Hb）溶液的Soret帶最大吸收峰出現(xiàn)在408 nm左右，另外，在Q帶、CT帶依次有500和640 nm兩個吸收峰，說明血紅蛋白保持著它原有的活性且二級結(jié)構(gòu)保持完好沒有破壞。當棒狀的納米ZnO分散液和Hb溶液混合后，最大吸收峰在408 nm左右，同時Q帶、CT帶依次有500，640 nm兩個很弱的峰，如圖2（C），這說明棒狀的納米ZnO分散液和Hb溶液混合后，相互作用結(jié)合在一起，同時血紅蛋白仍然保持著它原有的活性且二級結(jié)構(gòu)沒有被破壞。

2.3 修飾電極的直接電化學行為

圖3（A）是研究不同修飾電極在pH7.0的PBS溶液中的循環(huán)伏安曲線。圖3（A）中（a）、（b）依次是裸玻碳電極、ZnONRs/GCE修飾電極的循環(huán)伏安曲線，都沒有氧化還原峰。而ZnONRs-Hb/GCE修飾電極，如圖3（A）中（c），可以很明顯的看到有一對形狀相似的氧化還原峰，這表明Hb實現(xiàn)了它與電極間的直接電子傳遞，反應如下：Hb（FeⅢ）+e=Hb（FeⅡ）。圖3（B）是ZnO NRs-Hb/GCE修飾電極在pH7．0的PBS溶液中連續(xù)掃50圈的循環(huán)伏安曲線，可以看到，除了第一圈，氧化還原峰電位基本不變而且氧化峰電流也基本沒變，這表明Hb比較牢固的固定在玻碳電極上。

2.4 修飾電極不同掃速的循環(huán)伏安曲線

圖4（A）考察了不同掃描速度和氧化還原峰電流之間的關系，隨著掃速的增大，氧化還原峰電流也逐漸的增大，但氧化還原峰電位基本不變。當掃速在100～600mV/s（a→f）間變化時，如圖4（B）氧化還原峰電流與掃描速度成一次線性關系，表明這是一個表面控制的反應過程，即為薄層電化學行為。同時，也可以進一步說明Hb成功的固定到電極上并且實現(xiàn)了直接電子傳遞。

圖4 （A）ZnONRs-Hb/GCE修飾電極在磷酸緩沖溶液（pH7．0）中不同掃速的循環(huán)伏安的曲線；（B）峰電流對掃速的線性關系Fig．4 （A）Cyclic voltammograms（CVs）of ZnONRs-Hb/GCE in pH7．0 PBSsolutionwith differentscan ratesof（from a to f）100,200,300,400,500,and 600mV/s．（B）A plotofpeak currents vs．scan rates

2.5 溶液pH的影響

圖5 （A）ZnONRs-Hb/GCE修飾電極在不同pH磷酸緩沖溶液中不同掃速的循環(huán)伏安的曲線；（B）pH對式量電位E?的線性關系圖Fig．5 （A）Cyclic voltammogramsof ZnONRs-Hb/GCE in 0．05mol/LPBSsolutionwith different．pH:4．0,5．0, 6．0,7．0,8．0,9．0（from a to f）（B）A Plotof the formalpotentialsvs．pH values．Scan rate at200mV/s

用循環(huán)伏安法研究了溶液pH對修飾電極式量電位E?的影響。圖5（A）表明，修飾電極的循環(huán)伏安行為在很大程度上受到外部溶液pH值的影響，該反應是：HbFe（III）+H++e-?HbHFe（II），從圖中可以看到，當?shù)滓旱膒H值改變時，修飾電極的循環(huán)伏安氧化還原峰電位隨緩沖溶液pH值的增加而負移。在pH值在4．0～9．0（a→f）之間時，式量電位E?與溶液的pH值呈線性關系，如圖5（B），斜率是-52．7mV/pH，這一數(shù)值與伴隨一個質(zhì)子轉(zhuǎn)移的單電子可逆電極反應的理論值-57．6mV/pH（20℃）相接近。當從pH9．0返回到pH4．0測定，得到的循環(huán)伏安圖與之前的一致，說明該修飾電極有很好的穩(wěn)定性和可逆性。

2.6 修飾電極對過氧化氫（H2O2）的催化

從圖6插圖中，可以看到，裸玻碳電極、ZnO/ GCE修飾電極對H2O2均沒有催化還原作用。但ZnO NRs-Hb/GCE修飾電極對H2O2有明顯的電催化還原作用，如圖4-6（b→e）,隨著H2O2濃度的增大，還原峰逐漸的增大而氧化峰逐漸減小甚至消失。這表明ZnONRs-Hb/GCE修飾電極對H2O2有良好的電催化還原作用，反應是：H2O2+ 2HbHFe（II）→2HbFe（III）+2H2O

圖6 不同修飾電極在磷酸緩沖溶液（pH=6．9）中不含H2O2及含不同濃度的H2O2的循環(huán)伏安曲線，掃速:200mV/sFig．6 Cyclic voltammogramsof ZnONRs-Hb/GCEatscan rateof200mV/s in PBS（pH7．0）withoutH2O2（a）andwith 0．045mol/L ofH2O210μL（b）20μL（c）30μL（d）40μL（e）Inset:bare GCE（a）, ZnO/GCE atscan rate of200mV/s in 0．05mol/LPBS（pH7．0）withoutH2O2（b）and with 0．045mol/L of H2O2（c）

2.7 ZnO NRs-Hb/GCE修飾電極對過氧化氫（H2O2）的響應

圖7是ZnO NRs-Hb/GCE修飾電極在恒電位-300mV時對不同濃度的H2O2的響應情況。從圖7（A）中可以看出，ZnONRs-Hb/GCE修飾電極的響應電流隨H2O2濃度的增大而增大，每次加入H2O2后，其響應電流在3 s內(nèi)達到穩(wěn)定，說明ZnONRs-Hb/GCE修飾電極對H2O2的響應速度快。通過實驗結(jié)果計算得出，ZnONRs-Hb/GCE修飾電極對H2O2的響應的線性范圍是1．06×10-6～7．82×10-3mol/L（r=0．996），檢測限是8．86×10-7mol/L（S/N=3）。另外，根據(jù)圖7（B）的線性關系圖利用公式算得其Km是0．117mmol/L，表明修飾電極對H2O2的響應迅速而靈敏。

2.8 重現(xiàn)性和穩(wěn)定性

該文還對ZnO NRs-Hb/GCE修飾電極的重現(xiàn)性和穩(wěn)定性進行了研究。通過實驗發(fā)現(xiàn)，4支ZnO NRs-Hb/GCE修飾電極在相同條件下對在PBS（pH7．0）溶液中對0．15mmol/L的H2O2的響應電流的相對偏差是1．9%左右，說明制備的生物傳感器重現(xiàn)性好。同時，還考察了該修飾電極的穩(wěn)定性。發(fā)現(xiàn)，ZnO NRs-Hb/GCE修飾電極在pH7．0的PBS溶液中在0到-0．8 V電位窗口下，以200mV/s的速度連續(xù)掃描50圈，氧化還原峰電位、響應電流基本沒變，說明該修飾電極比較穩(wěn)定。ZnONRs-Hb/GCE修飾電極在0．15mmol/LH2O2中測定后在4℃放置兩周后，相同實驗條件下對H2O2的響應電流是原來的96%，表明制備的生物傳感器的重現(xiàn)性和穩(wěn)定性都比較好。

圖7 （A）ZnONRs-Hb/GCE修飾電極在10mL pH7.0 PBS溶液中計時電流曲線（工作電位：-300mV）（B）響應電流對H2O2濃度線性關系圖Fig.7 （A）A typicalamperometric i–tcurveof ZnONRs-Hb/GCEat-300mV in 10mLPBS solutionwith pH7.0（B）A plotofsteady-state currentvs.H2O2concentration

3 結(jié)論

該文將高等電點棒狀納米ZnO分散液和低等電點的血紅蛋白酶溶液混合，利用它們的等電點較大的差異性,在溶液中相互作用組裝，然后再自組裝修飾到玻碳電極上，制備了直接電子轉(zhuǎn)移的生物傳感器。制備過程簡單，易操作，重現(xiàn)性高。對H2O2的響應迅速，有較寬的檢測濃度范圍、檢測限低。

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ZnO-nanorods-based self-assembly in liquid phase for immobilization of hemoglobin and directelectrochem istry sensor

Zhang Qi,Duan Guo-ping,Guo Xiao-yu*,Yang Hai-feng*
(The Education Ministry Key Lab ofResource Chemistry,DepartmentofChemistry,ShanghaiNormalUniversity, Shanghai200234,China)

Self-assemblymethod could be used to synthesize nanomaterial-based biosensor by the help of polyelectrolyte such as poly(diallyldimethylammonium chloride)(PDDA)．However,polyelectrolyte resulted in severe aggregation ofnanomaterialsor damaging the bioactivity ofhemoglobin(Hb)．In addition,the processofpreparationwas relatively complicate and poor reproducibility．In thiswork,we developed a simplermethod that the ZnONPs sufficiently bound with Hb,taking advantage of the great difference of isoelectric pointbetween ZnONPs and Hb,and then self-assemblemethod wasused tomodify them on the cleaned glassy carbon electrode(GCE)．The directelectron transfer of Hb was realized on the as-prepared electrode．UV-vis Spectrophotometer,TEM and cyclic voltammetrywere used to characterize the synthesis processofbiosensor．The responses of H2O2were linearly proportional to the concentration from 1．06×10-6～7．82×10-3mol/L with a detection limitof8．86×10-7mol/L(S/N=3)．R．S．Dwas about l．9%foras-prepared electrodes in 0．15mmol/LH2O2in 0．05mol/LPBS(pH7．0)．Thisbiosensor exhibited the facile-made,good reproducibility and stability．

ZnO nanoparticles;hemoglobin;self-assembly;directelectron transfer

國家自然科學基金面上項目（21475088）

*通信聯(lián)系人，E-mail:haifengyang@yahoo．com，gxy2012@shnu．edu．cn，Tel．:021-64322144