基于目標(biāo)物引發(fā)的滾環(huán)擴(kuò)增信號(hào)放大策略構(gòu)建電致化學(xué)發(fā)光傳感器用于m icroRNA檢測(cè)

何曉靜，鐘毅欣，蔣 偉,馬紹勇,趙 靜，卓 穎*

(1.重慶醫(yī)科大學(xué)超聲影像學(xué)研究所，重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院，重慶400010)

(2.重慶市納米材料及傳感技術(shù)工程實(shí)驗(yàn)室，西南大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院，重慶400715)

基于目標(biāo)物引發(fā)的滾環(huán)擴(kuò)增信號(hào)放大策略構(gòu)建電致化學(xué)發(fā)光傳感器用于m icroRNA檢測(cè)

何曉靜1*，鐘毅欣1，蔣 偉1,馬紹勇2,趙 靜2，卓 穎2*

(1.重慶醫(yī)科大學(xué)超聲影像學(xué)研究所，重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院，重慶400010)

(2.重慶市納米材料及傳感技術(shù)工程實(shí)驗(yàn)室，西南大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院，重慶400715)

該實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)了基于目標(biāo)物循環(huán)引發(fā)滾換擴(kuò)增（CI-RCA）的電致化學(xué)發(fā)光（ECL）傳感器。首先，設(shè)計(jì)了由結(jié)合區(qū)域與多鳥(niǎo)嘌呤區(qū)域兩部分組成的啞鈴型掛鎖探針作為滾環(huán)擴(kuò)增模板。該模板中的結(jié)合區(qū)域能夠與目標(biāo)miRNA以及固載電極表面的引物雜交形成三元“Y”形結(jié)構(gòu)，進(jìn)而引發(fā)滾環(huán)擴(kuò)增，產(chǎn)生連環(huán)的多胞嘧啶序列的單鏈DNA。當(dāng)滾環(huán)擴(kuò)增完成對(duì)模板的一次復(fù)制時(shí)，目標(biāo)miRNA被置換下來(lái)，進(jìn)而協(xié)助下一條引物與模板的結(jié)合，引發(fā)下一個(gè)滾環(huán)擴(kuò)增，生成大量的引物3端延伸出的多胞嘧啶DNA單鏈?；贑-Ag-C的配位作用，Ag+被固定在電極表面，進(jìn)而增強(qiáng)過(guò)硫酸根體系的ECL信號(hào)。因此，隨著目標(biāo)miRNA濃度的增加，ECL信號(hào)強(qiáng)度越高。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明該傳感器在1.0 fmol/L～1.0 nmol/L濃度范圍內(nèi)對(duì)miRNA有良好的線(xiàn)性響應(yīng)。

電致化學(xué)發(fā)光；滾環(huán)擴(kuò)增；miRNA

0 引言

滾環(huán)擴(kuò)增 （rolling circle amplification，RCA）是新近發(fā)展起來(lái)的一種恒溫核酸擴(kuò)增方法[1]。以環(huán)狀DNA為模板，通過(guò)一個(gè)短的DNA引物（與部分環(huán)狀模板互補(bǔ)），在酶催化下將dNTPs轉(zhuǎn)變成單鏈DNA，此單鏈DNA包含成百上千個(gè)重復(fù)的模板互補(bǔ)片段。這種方法不僅可以直接擴(kuò)增DNA和RNA，還可以實(shí)現(xiàn)對(duì)靶核酸的信號(hào)放大，靈敏度達(dá)到一個(gè)拷貝的核酸分子，因此在核酸檢測(cè)領(lǐng)域具有廣闊的應(yīng)用潛力[2]。在之前的基于滾環(huán)擴(kuò)增的信號(hào)放大策略中，以目標(biāo)物直接作為引物或者構(gòu)建一個(gè)目標(biāo)物循環(huán)產(chǎn)生引物再進(jìn)行滾環(huán)擴(kuò)增是常用的方法。以目標(biāo)物直接在作為引物的方法具有操作簡(jiǎn)單的優(yōu)勢(shì)，在均相體系，如熒光檢測(cè)中廣泛運(yùn)用，然而在電化學(xué)，表面等離子共振等需要固載界面的體系中受到限制。最近的研究指出，級(jí)聯(lián)目標(biāo)物循環(huán)的滾環(huán)擴(kuò)增雖然能夠解決界面固載的問(wèn)題，但同時(shí)也讓操作變得復(fù)雜[3-4]。在此，提出了一種基于鏈置換的目標(biāo)物循環(huán)與滾環(huán)擴(kuò)增同步進(jìn)行的新型信號(hào)放大策略。

電致化學(xué)發(fā)光（Electrochemiluminescence,簡(jiǎn)稱(chēng)ECL）是電化學(xué)與化學(xué)發(fā)光相結(jié)合的檢測(cè)技術(shù)，它具有儀器設(shè)備簡(jiǎn)單、操作方便、易于實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化、靈敏度高、選擇性高、重現(xiàn)性好、抗干擾能力強(qiáng)、線(xiàn)性響應(yīng)范圍寬和分析速度快等特點(diǎn)[5-6]。因此，近些年來(lái)ECL分析技術(shù)被廣泛地應(yīng)用于分析檢測(cè)領(lǐng)域，特別是將該技術(shù)與生物識(shí)別和傳感技術(shù)相結(jié)合構(gòu)建了一系列生物傳感器，實(shí)現(xiàn)了對(duì)細(xì)胞、蛋白質(zhì)、核酸的靈敏檢測(cè)。常見(jiàn)的電致化學(xué)發(fā)光試劑主要有S2O82-、Ru(bpy)32+及其衍生物、Luminol及其衍生物、半導(dǎo)體納米材料如量子點(diǎn)等[7]。相比其他發(fā)光體系之下S2O82--O2體系廉價(jià)而穩(wěn)定但是存在不容易固載的問(wèn)題。因此，常以共反應(yīng)試劑（如苝四甲酸及其衍生物）作為信號(hào)標(biāo)記物或S2O82-僅作為共反應(yīng)試劑[8]。Au對(duì)S2O82--O2體系有強(qiáng)烈的增強(qiáng)，與Au性質(zhì)相近的Ag可能同樣具有增強(qiáng)作用。而Ag可以與胞嘧啶(C)作用形成“C-Ag-C”的穩(wěn)定結(jié)構(gòu)，因此，Ag+固載于多胞嘧啶的核酸序列有望構(gòu)建一種簡(jiǎn)單廉價(jià)的S2O82--O2電致化學(xué)發(fā)光體系。

在該實(shí)驗(yàn)中，設(shè)計(jì)了基于目標(biāo)物循環(huán)引發(fā)滾換擴(kuò)增（CI-RCA）的ECL傳感器用于microRNA（miRNA）檢測(cè)。首先，精心設(shè)計(jì)了由結(jié)合區(qū)域與多鳥(niǎo)嘌呤區(qū)域兩部分組成的啞鈴型掛鎖探針作為滾環(huán)擴(kuò)增模板。結(jié)合區(qū)域能夠與目標(biāo)miRNA以及固載電極表面的引物雜交形成三元“Y”形結(jié)構(gòu)，進(jìn)而引發(fā)滾環(huán)擴(kuò)增，產(chǎn)生連環(huán)的多胞嘧啶序列的單鏈DNA。當(dāng)滾環(huán)擴(kuò)增完成對(duì)模板的一次復(fù)制時(shí)，目標(biāo)miRNA被置換下來(lái)，進(jìn)而協(xié)助下一條引物與模板的結(jié)合，引發(fā)下一個(gè)滾環(huán)擴(kuò)增，生成大量的引物3端延伸出的多胞嘧啶DNA單鏈。基于C-Ag-C的配位作用，Ag+被固定在電極表面，進(jìn)而增強(qiáng)過(guò)硫酸根體系的ECL信號(hào)。因此，隨著目標(biāo)miRNA濃度的增加，ECL信號(hào)強(qiáng)度越高。實(shí)驗(yàn)表明該傳感器在目標(biāo)物濃度為1.0 fmol/L～1.0 nmol/L的范圍內(nèi)具有良好的線(xiàn)性響應(yīng)，檢測(cè)限為0.32 fmol/L，信噪比為S/N=3。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

MPI-A型ECL分析儀 （西安瑞邁電子科學(xué)技術(shù)有限公司），CHI610A電化學(xué)工作站（上海辰華儀器公司），BRANSONIC 200超聲清洗儀 （德國(guó)BRANSON ULTRASCHALL公司）；TGL-20M高速臺(tái)式冷凍離心機(jī)（長(zhǎng)沙湘儀離心機(jī)儀器有限公司）。三電極體系：1、玻碳電極（GCE，Φ=4mm）及其修飾電極為工作電極，飽和甘汞電極為參比電極，鉑絲為對(duì)電極；2、玻碳電極 （GCE，Φ=4 mm）及其修飾電極為工作電極，Ag/AgCl電極為參比電極，鉑絲為對(duì)電極。移液槍?zhuān)ǔ啥挤街劭萍奸_(kāi)發(fā)公司）和SCZL-2數(shù)顯智能控溫磁力攪拌器用于適體Ⅱ制備過(guò)程的加樣和攪拌。

氯鉑酸（HPtCl6，0.1mol/L）；過(guò)硫酸鈉（分析純A.R.）；Tris-HCl緩沖溶液 （pH7.4）；1μmol/L AgNO3溶液；1%BSA溶液；1U/μLPhi29 DNA聚合酶;25mmol/L dNTP mixture溶液；10U/μL T4 DNA連接酶；磷酸緩沖溶液 （PBS，0.1 mol/L，pH7.4）是由0.1mol/LNa2HPO4，0.1mol/L KH2PO4和0.1mol/LKCl混合配制而成；所用其它試劑均為分析純或優(yōu)級(jí)純，實(shí)驗(yàn)用水均為二次去離子水。所用到的寡聚核酸序列如表1所示。

1.2 傳感器組裝

將裸電極打磨洗凈,采用電位溶出分析的方法，電位設(shè)置為-0．25 V，沉積時(shí)間為30 s,于氯鉑酸（HPtCl6，0．1mol/L）溶液中沉積鉑。用去離子水漂凈后，滴加10μL的1μmol/LCP（TE buffer，pH8．0）于電極表面，在常溫下修飾1 h。然后，用去離子水漂凈，滴加10μLMCH溶液（1mmol/L, 75%乙醇）封閉非特異性結(jié)合位點(diǎn)，并活化組裝在沉積鉑表面的CP。電極制備過(guò)程示意圖見(jiàn)圖1。

表1 寡聚核酸序列Tab.1 Sequence information for the nucleic acidsused in this study

1.3 目標(biāo)物引發(fā)的滾環(huán)擴(kuò)增過(guò)程

PP溶液的處理：將PP探針在12000 r/min下離心20min，用Tris-HCl緩沖液（pH8．0）溶解，配成100μmol/L溶液。然后在95℃退火5min。目標(biāo)物引發(fā)的滾環(huán)擴(kuò)增過(guò)程：加酶緩沖,將2μL 1U/ μL Phi29 DNA聚合酶、4μL 25 mmol/L dNTP mixture溶液、2μL 10U/μLT4DNA連接酶、2μL的1μmol/LPP、6μL不同濃度的miRNA混合搖勻制得20μL體系。滴加10μL的20μL體系溶液于傳感器表面在30℃下溫育2．5 h后，用去離子水漂凈。滾環(huán)擴(kuò)增過(guò)程示意圖請(qǐng)見(jiàn)圖1插圖。

1.4 ECL檢測(cè)

滴加10μL的1×10-6mol/LAgNO3溶液于擴(kuò)增之后的傳感器表面，室溫下靜置1 h后用去離子水漂洗。于含有0．1mol/LK2S2O8的0．1mol/L PBS（pH7．4）底液中，運(yùn)用循環(huán)伏安法進(jìn)行ECL檢測(cè)。實(shí)驗(yàn)參數(shù)設(shè)置為：光電倍增管高壓800 V，掃描速率0．2 V/s，電位-2～0 V。

圖1 傳感器的制備過(guò)程示意圖Fig．1 Schematic diagram of the stepwise sensor construction process

2 結(jié)果與討論

2.1 界面的電化學(xué)表征

交流阻抗譜作為一種有效檢測(cè)修飾電極表面膜的界面性質(zhì)的手段。圖2裸電極上進(jìn)行逐層修飾過(guò)程的Faradaic阻抗表征圖譜。圖2中a是裸電極阻抗變化的曲線(xiàn)，b是裸電極修飾鉑后阻礙電極表面電子轉(zhuǎn)移，阻抗增大；c曲線(xiàn)是CP后相對(duì)于b電極表面存在較大的電子轉(zhuǎn)移電阻，阻抗增大；d、e曲線(xiàn)二者半圓直徑發(fā)生急劇增加，表明d曲線(xiàn)是MCH封閉后阻抗明顯較c增強(qiáng)，e曲線(xiàn)則是吸附目標(biāo)物后電極表面的鏈增長(zhǎng)可顯著降低界面上的電子轉(zhuǎn)移率，說(shuō)明傳感器成功組裝并且滾環(huán)擴(kuò)增成功進(jìn)行。

通過(guò)循環(huán)伏安實(shí)驗(yàn)用于檢測(cè)電極表面逐級(jí)修飾過(guò)程（如圖3所示）。循環(huán)伏安曲線(xiàn)圖a為裸電極在[Fe(CN)6]3-/4-中氧化還原曲線(xiàn)；修飾鉑后促進(jìn)電極表面電子轉(zhuǎn)移增加表面積，電流減小（曲線(xiàn)b）；組裝引物CP后由于DNA的負(fù)電性與[Fe(CN)6]3-/4-之間排斥作用，電流減?。籑CH封閉后阻礙作用增強(qiáng)，電流繼續(xù)減小，e曲線(xiàn)則是吸附目標(biāo)物后電極表面的鏈增長(zhǎng)可顯著降低界面上的電子轉(zhuǎn)移率，電流進(jìn)一步降低。同樣說(shuō)明傳感器成功組裝且滾環(huán)擴(kuò)增成功進(jìn)行。

圖2 在10mmol/L[Fe(CN)6]3-/4-中的電化學(xué)阻抗譜圖(a)裸電極，(b)納米鉑修飾電極，(c)修飾了CP，(d)修飾了MCH,(e)修飾了20μL體系溶液(含目標(biāo)物miRNA)Fig.2 The characterization ofEISin 10mmol/L [Fe(CN)6]3-/4-(a.bare GCE,b.Pt/GCE,c.CP/Pt/GCE, d.MCH/CP/Pt/GCE,e.miRNA/MCH/CP/Pt/GCE)

圖3 在10mmol/L[Fe(CN)6]3-/4-中的循環(huán)伏安曲線(xiàn)圖(a)裸電極，(b)納米鉑修飾電極，(c)修飾了CP，(d)修飾了MCH,(e)修飾了20μL體系溶液(含目標(biāo)物miRNA)Fig.3 The characterization ofCV(a.bare GCE,b.Pt/GCE, c.CP/Pt/GCE,d.MCH/CP/Pt/GCE,e.miRNA/MCH/CP/Pt/ GCE)

2.2 修飾電極的ECL表征

將修飾電極在濃度為0.1mol/L的S2O82-的檢測(cè)底液中運(yùn)用循環(huán)伏安法進(jìn)行ECL檢測(cè)，其ECL響應(yīng)變化可以表征傳感器的制備過(guò)程。如圖4所示：裸電極在S2O82-溶液產(chǎn)生的ECL信號(hào)較高（曲線(xiàn)a），據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，它主要是由于S2O82--O2體系的發(fā)光。當(dāng)鉑固載到電極表面后，由于鉑、CP、MCH等不能夠增強(qiáng)S2O82--O2體系的發(fā)光，使得ECL信號(hào)變化不明顯 （曲線(xiàn)b、c、d）。當(dāng)復(fù)合物miRNA孵育到修飾電極上，由于miRNA引發(fā)滾環(huán)擴(kuò)增，因此ECL信號(hào)明顯降低（e曲線(xiàn)）。

圖4 傳感器制備過(guò)程ECL表征（a.裸電極，b.Pt/裸電極，c.CP/Pt/裸電極，d.MCH/CP/P裸電極，e.miRNA/ MCH/CP/Pt/裸電極）Fig.4 ECL characterization ofsensor preparation process (a.bare GCE,b.Pt/GCE,c.CP/Pt/GCE,d.MCH/CP/Pt/GCE,e.miRNA/MCH/CP/Pt/GCE)

2.3 實(shí)驗(yàn)條件的優(yōu)化

2.3.1 修飾CP的時(shí)間優(yōu)化

讓CP修飾時(shí)間分別為1 h、1.5 h、2 h、2.5 h于[Fe(CN)6]3-/4-中測(cè)CV。圖5表明CP修飾1～2.5 h內(nèi)電流值經(jīng)歷了先減小后增大的趨勢(shì)，再結(jié)合時(shí)間因素考慮，1 h是CP修飾的較好時(shí)間且不影響實(shí)驗(yàn)效果。故選定CP修飾時(shí)間為1 h。

圖5 CP修飾時(shí)間不同對(duì)膜電流的影響Fig.5 Different to the influence ofmembrane currentCP modification time

2.3.2 修飾20微升體系后時(shí)間優(yōu)化

讓10μL的20μL體系溶液于30℃下修飾時(shí)間分別為3 h、6 h、9 h于S2O82--O2體系測(cè)ECL。圖6表明修飾時(shí)間明顯是3 h時(shí)ECL信號(hào)最強(qiáng)，故選定修飾20μL體系溶液的時(shí)間為3 h。

2.4 修飾電極的ECL線(xiàn)性

優(yōu)化條件下,在電極表面修飾不同濃度的miRNA溶液，于0．1mol/LK2S2O8（pH7．4，PBS）的檢測(cè)底液中，在-2．0～0 V范圍內(nèi)進(jìn)行ECL檢測(cè)，結(jié)果如圖7所示。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，在1．0×10-15～1．0×10-9mol/L的濃度范圍內(nèi)，ECL響應(yīng)信號(hào)與miRNA濃度成線(xiàn)性關(guān)系。其線(xiàn)性回歸方程為：y= 7966．14286+516．43 lg c（c為miRNA的濃度），相關(guān)系數(shù)為r2=0．9985。

圖6 20μL體系修飾時(shí)間不同對(duì)ECL信號(hào)的影響Fig．6 Effectsof incubation timeon ECL intensity of the sensor

圖7 （A）傳感器對(duì)不同濃度miRNA的ECL響應(yīng)和（B）ECL強(qiáng)度相對(duì)于miRNA濃度對(duì)數(shù)的校準(zhǔn)曲線(xiàn)Fig．7 (A)ECL intensity of the proposed biosensor incubated with differentconcentration of themiRNA:1．0×10-9mol/L,1．0×10-10mol/L,1．0×10-11mol/L,1．0×10-12mol/L,1．0×10-13mol/L,1．0×10-14mol/L,1．0×10-15mol/L(from a to g)．(B)Relationship between the ECL intensity and the logarithm of the concentration ofmiRNA

2.5 ECL傳感器的選擇性

分別用blank(BSA代替)、10-6mol/L oligo 1、10-6mol/Loligo 2、（oligo 1,oligo 2,miRNA）混合物代替20μL體系溶液中miRNA，同時(shí)10-9mol/L miRNA的20μL體系溶液作對(duì)照。如圖8,BSA代替miRNA作為空白時(shí)ECL信號(hào)很低,同樣的用oligo 1、oligo 2代替miRNA時(shí)的ECL信號(hào)也很低，而含有目標(biāo)物miRNA及 （oligo 1,oligo 2, miRNA）混合物的ECL信號(hào)很高，說(shuō)明該實(shí)驗(yàn)ECL傳感器對(duì)目標(biāo)物miRNA具有較好的選擇性。

3 結(jié)論

圖8 ECL傳感器的選擇性Fig．8 The selectivity ofECL sensors

在該實(shí)驗(yàn)中設(shè)計(jì)了基于目標(biāo)物循環(huán)引發(fā)滾換擴(kuò)增的電致化學(xué)發(fā)光傳感器。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，隨著目標(biāo)物miRNA濃度的增加，ECL信號(hào)強(qiáng)度越高，通過(guò)測(cè)量ECL信號(hào)就能夠?qū)崿F(xiàn)對(duì)miRNA濃度的檢測(cè)。電致化學(xué)發(fā)光試驗(yàn)表明在miRNA濃度為1.0 fmol/L～1.0 nmol/L的范圍內(nèi)，該傳感器的ECL信號(hào)隨目標(biāo)物miRNA濃度增加而增強(qiáng)，表現(xiàn)出良好的線(xiàn)性關(guān)系。當(dāng)高濃度的干擾DNA序列共存時(shí)，目標(biāo)物miRNA的ECL響應(yīng)信號(hào)依然高出干擾DNA序列好幾倍，說(shuō)明該傳感器能夠?qū)δ繕?biāo)物miRNA實(shí)現(xiàn)高靈敏度，高選擇性的檢測(cè)。

[1]劉青杰,陳德清.滾環(huán)DNA擴(kuò)增技術(shù)及其應(yīng)用[J].輻射研究與輻射工藝學(xué)報(bào),2007,25(1):5-9.

[2]LiM M,LiF,Zhang ZQ,etal.Rolling Circle Amplification:a Versatile Tool for Chemical Biology,Materials Science and Medicine[J].Chem.Soc.Rev,2014,43: 3324.

[3]李啟明,馬學(xué)軍.RCA技術(shù)的應(yīng)用及研究進(jìn)展[J].中華實(shí)驗(yàn)和臨床病毒學(xué)雜志,2006,20:99-100.

[4]喬婉瓊,周東蕊,楊耀,等.滾環(huán)擴(kuò)增原理及其在醫(yī)藥領(lǐng)域的應(yīng)用[J].中國(guó)藥科大學(xué)學(xué)報(bào),2006,37(3):201-205.

[5]廖玉紅.基于Nafion為基體的復(fù)合膜構(gòu)建的電化學(xué)免疫傳感器和電致化學(xué)發(fā)光適體傳感器的研究[D].重慶:西南大學(xué),2012.4-18.

[6]王曉英.基于電致化學(xué)發(fā)光技術(shù)的納米生傳感器的設(shè)計(jì)與研究[D].上海:華東師范大學(xué),2008.1-2.

[7]Jie G,Liu P,Zhang S.Highly Enhanced Electrochemiluminescence of Novel Gold/Silica/CdSe-CdSnanostructures for Ultrasensitive Immunoassay of Protein Tumor marker[J].Chem.Commun.,2010,46:1323-1325.

[8]Ma M N,Zhang X,Zhuo Y,etal.An Amplified Electrochemiluminescent Aptasensorusing Au Nanoparticles Capped by 3,4,9,10-perylene Tetracarboxylic Acidthiosemicarbazidefunctionalized C60Nnanocomposites As SignalEnhancement[J].Nanoscale.,2015,7(5):2085-2092.

A novelelectrochem ilum inescenc biosensor wasapplied form icroRNA detection based on cyclic binding-induced rolling circleamplification(CI-RCA)strategy

He Xiao-jing1*,Zhong Yi-xin1,JiangWei1,Ma Shao-yong2,Zhao Jing2,Zhuo Ying2*
(1.Institute ofUltrasound Imaging ofChongqingMedicalUniversity,The Second Affiliated HospitalofChongqing MedicalUniversity,Chongqing 400010,China)
(2.Chongqing Nanomaterialsand Sensing Technology Engineering Laboratory,College ofChemistry and Chemical Engineering,SouthwestUniversity,Chongqing400715,China)

In thiswork,an electrochemiluminescenc(ECL)biosensorbased on cyclic binding-induced rolling circle amplification(CI-RCA)strategywas firstproposed and applied in ECLbiosensor formicroRNA(miRNA)detection. Herein,a dumbbell-like padlock probewas elaborated with the combination ofguanine-rich sequence and binding region.The targetmiRNA acted asa binderwhich supported the hybridization of the primer and the padlock probe. Then the rolling circle amplification was triggered and the targetmiRNA would be released on accountof the strand displacementpolymerization and join into another reaction cycle.Asa result,large amountof cytosine-riched DNA single strandswere synthesized on the surface of the biosensor.As the specific affinitywith cytosine,silver ionswere assembled on the biosensor,which efficiently enhanced the ECL emission of the peroxydisulfate/oxygen(S2O82-/O2) system.Hence,the concentration of target miRNA could be read out through the ECL intensity.With the amplification of CI-RCA,the biosensor required very simple operations and demonstrated ultrasensitive response to targetmiRNA.The ECL assay formiRNA-21 detection is developed with excellent sensitivity of a concentration variation from 1.0 fmol/L to 1.0 nmol/L and limitofdetection down to 0.3 fmol/L.

electrochemiluminescence;rolling circle amplification;miRNA

國(guó)家自然科學(xué)基金青年科學(xué)基金項(xiàng)目(81401382)；重慶市衛(wèi)生計(jì)生委醫(yī)學(xué)科研項(xiàng)目(2016MSXM024)

*通信聯(lián)系人，E-mail:He_xiaojing1006@163.com,Tel.:Fax:023-63693060