楊茜
【摘要】數(shù)字PCR是繼第一代、第二代PCR技術(shù)之后,迅速發(fā)展起來(lái)的一種核酸絕對(duì)定量技術(shù)。在大量反應(yīng)室中獨(dú)立擴(kuò)增單分子核酸,采集產(chǎn)生的熒光信號(hào),通過(guò)計(jì)算得到檢測(cè)結(jié)果。在病原微生物檢測(cè)、產(chǎn)前診斷以及癌基因診斷等領(lǐng)域發(fā)揮著重要作用。本文對(duì)數(shù)字PCR的原理、分類(lèi)以及應(yīng)用方面進(jìn)行了綜述。
【關(guān)鍵詞】數(shù)字PCR;醫(yī)學(xué)檢驗(yàn);分類(lèi);應(yīng)用
【中圖分類(lèi)號(hào)】Q503 【文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼】A 【文章編號(hào)】ISSN.2095.6681.2018.06.17..02
1985年K.Mullis發(fā)明的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)技術(shù)(polymerase chain reaction,PCR),可以在體外模擬體內(nèi)核酸的合成過(guò)程,大大縮短了實(shí)驗(yàn)周期、降低科研成本,是生命科學(xué)領(lǐng)域的一項(xiàng)革命性壯舉。但傳統(tǒng)的PCR技術(shù)也有弊端,僅能進(jìn)行半定量測(cè)定,在分析產(chǎn)物時(shí)需要進(jìn)行開(kāi)蓋操作,容易產(chǎn)生假陽(yáng)性[1]。隨著科學(xué)技術(shù)的發(fā)展,能夠?qū)崟r(shí)定量檢測(cè)核酸的實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)(quantitative PCR,qPCR)、數(shù)字PCR技術(shù)(digital PCR,dPCR)也相繼出現(xiàn),一舉攻克傳統(tǒng)PCR的技術(shù)難題。而數(shù)字PCR憑借其高通量、高準(zhǔn)確度的特點(diǎn),有著極為廣泛的應(yīng)用前景[2]。
1 數(shù)字PCR技術(shù)的原理
數(shù)字PCR技術(shù)包括兩部分,PCR擴(kuò)增以及熒光信號(hào)分析。它的原理是將含有DNA模板的反應(yīng)體系稀釋分離成單分子,分配到大量的反應(yīng)單元中進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng),采集每個(gè)反應(yīng)單元的熒光信號(hào),有熒光信號(hào)記為1,無(wú)熒光信號(hào)記為0。通過(guò)陽(yáng)性微滴的比例或泊松分布公式計(jì)算樣本的原始濃度或拷貝數(shù),最終獲得結(jié)果[3]。
2 數(shù)字PCR技術(shù)分類(lèi)
數(shù)字PCR的靈敏度取決于檢測(cè)器的靈敏度、PCR擴(kuò)增效率以及反應(yīng)單元的數(shù)目。根據(jù)反應(yīng)單元形成的不同方式,將PCR技術(shù)分為三類(lèi)系統(tǒng):
2.1 微反應(yīng)室數(shù)字
PCR是在不銹鋼芯上刻蝕了數(shù)以千計(jì)的微反應(yīng)室,同時(shí)也將每個(gè)反應(yīng)單元的體積從微升級(jí)降至納升級(jí),提高了樣品同量,但需要借助高通量的自動(dòng)點(diǎn)樣儀,提高了儀器成本和操作復(fù)雜性[4]。
2.2 微流控芯片數(shù)字
PCR是建立在微流體技術(shù)、納米制造技術(shù)和微電子技術(shù)等發(fā)展之上的,它的出現(xiàn)為我們提供了一個(gè)實(shí)現(xiàn)低成本、小體積和高通量PCR分析的理想平臺(tái)[5]。
2.3 液滴數(shù)字
PCR系統(tǒng)是在擴(kuò)增之前進(jìn)行微滴化處理,以極低的濃度包裹于油水兩項(xiàng)形成的數(shù)萬(wàn)個(gè)納升至皮升級(jí)液滴中,每個(gè)液滴都是一個(gè)獨(dú)立的反應(yīng)體系,擴(kuò)增后的產(chǎn)物富集在磁性微球上,破乳后收集進(jìn)行測(cè)序[6]。該技術(shù)的優(yōu)勢(shì)在于,能夠把不同模板的DNA分隔在不同的乳液中,避免了引物與引物之間、不同產(chǎn)物之間的相互影響[7]。同時(shí)可以在不同的反應(yīng)室中進(jìn)行同時(shí)擴(kuò)增,實(shí)現(xiàn)了高通量測(cè)定。
3 數(shù)字PCR技術(shù)應(yīng)用
3.1 病原微生物的檢測(cè)
目前醫(yī)院主要通過(guò)qPCR對(duì)血液、腦脊液等臨床樣本進(jìn)行病原微生物的檢測(cè),但qPCR仍存在較多缺點(diǎn):不同實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)品或者對(duì)照品之間存在誤差,導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)室內(nèi)或者不同實(shí)驗(yàn)室之間qPCR的檢測(cè)結(jié)果有差異,需建立統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)曲線[2] ;Yan[8]等采取感染H7N9的患者十個(gè)不同治療時(shí)期的樣本,分別進(jìn)行qPCR及dPCR檢測(cè),發(fā)現(xiàn)對(duì)于qPCR陰性的樣本,dPCR仍可以檢測(cè)出病毒的存在,說(shuō)明dPCR的靈敏度遠(yuǎn)高于qPCR。數(shù)字PCR不僅可以對(duì)病原體定性,而且還能對(duì)病原體DNA或RNA序列進(jìn)行絕對(duì)定量,從而對(duì)疾病進(jìn)行早期診斷、藥物療效觀察、病情判斷及預(yù)后觀察,目前數(shù)字PCR技術(shù)已廣泛的應(yīng)用于HBV、HIV、甲型流感病毒等臨床領(lǐng)域[9]。
3.2 腫瘤診斷
許多腫瘤早期就出現(xiàn)癌基因的突變和表達(dá)異常,dPCR技術(shù)不僅能有效地檢測(cè)到癌基因的突變,而且可以準(zhǔn)確定量其表達(dá)。如肺癌表皮生長(zhǎng)因子受體、神經(jīng)膠質(zhì)瘤異檸檬酸脫氫酶及葡萄膜黑色素瘤突變的檢測(cè)[9]。miRNA是一類(lèi)由內(nèi)源基因編碼的長(zhǎng)度約為22個(gè)核苷酸的非編碼單鏈RNA分子,它們?cè)趧?dòng)植物中參與轉(zhuǎn)錄后基因表達(dá)調(diào)控,其與癌癥也密切相關(guān)[10]。田輝等人[11]建立了一種基于連接反應(yīng)的微滴式數(shù)字PCR檢測(cè)單細(xì)胞中miRNA,這與研究與miRNA有關(guān)的疾病有著重要的意義。
3.3 產(chǎn)前診斷
產(chǎn)前診斷可以在出生前對(duì)胎兒的發(fā)育狀態(tài)、患有的疾病等方面進(jìn)行檢測(cè)。傳統(tǒng)的侵入方法如羊水穿刺和絨毛取樣,存在讓孕婦流產(chǎn)的風(fēng)險(xiǎn)[10]。1997年,LO[12]發(fā)現(xiàn)了存在于孕婦外周血的胎兒游離的cffDN A,為無(wú)創(chuàng)產(chǎn)前診斷提供了新的思路。2017年,LO[13]利用數(shù)字PCR進(jìn)行了cffDNA的異常分析,用于21三體綜合征的診斷,上述方法可檢測(cè)血液中25%的胎兒基因。Barrett[14]利用cffDNA進(jìn)行了鐮狀紅細(xì)胞貧血的檢測(cè)。
dPCR作為一項(xiàng)新的技術(shù),還存在許多問(wèn)題需要解決和探討。相信隨著科技的進(jìn)步與技術(shù)的革新,該技術(shù)定將廣泛的應(yīng)用在生命科學(xué)的各個(gè)領(lǐng)域。
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本文編輯:王雨辰