流感病毒疫苗原液制備中不同品種胚蛋對(duì)原液制備的影響研究

蔡鶴鳴 徐宇虹

【摘要】目的：通過選用3種不同的胚蛋（海蘭白父母代、海蘭白商品代和京白系，其中海蘭白父母代胚蛋為對(duì)照品）進(jìn)行流感病毒接種，觀察病毒在三種胚蛋中的培養(yǎng)情況，在海蘭白商品代和京白系中選出適合生產(chǎn)用的胚蛋。方法：原液的生產(chǎn)方式按照現(xiàn)行的生產(chǎn)工藝進(jìn)行生產(chǎn)，比較原液的蛋白含量、血凝素含量、內(nèi)毒素含量等各項(xiàng)數(shù)據(jù)。結(jié)果：兩種實(shí)驗(yàn)胚蛋的內(nèi)毒素含量都低于海蘭白父母代，蛋白質(zhì)含量和血凝素含量都高于海蘭白父母代。結(jié)論：兩種候選胚蛋都適合于生產(chǎn)流感病毒疫苗。

【關(guān)鍵詞】流感病毒疫苗；蛋白質(zhì)；血凝素；內(nèi)毒素

流行性感冒病毒，簡(jiǎn)稱流感病毒，是有包膜的RNA病毒，屬正粘病毒科m主要通過人類談話時(shí)的飛沫、與患有流感的病人的接觸或與被流感病毒污染的物品接觸而傳播。流感病毒包括了人流感病毒和動(dòng)物流感病毒，而人流感病毒根據(jù)病毒核蛋白的抗原性又可以分為甲（A）、乙（B）、丙（C）三種類型，都是流感的病原體。在流感流行期，無(wú)論成人還是兒童，通常咳嗽和發(fā)熱是患流感的基本特征[2-4]，發(fā)熱一般在38-40度范圍，但可能會(huì)更高。

在前面提到的3種類型的病毒中，甲型流感病毒抗原性極其容易發(fā)生變異，因此曾引起過多次世界性的大流行.在20世紀(jì)時(shí)就爆發(fā)了三次流感大流行，分別是1918-1919年的西班牙大流感、1957-1958年的亞洲流感以及1968-1969年的香港流感。僅僅1918-1919年的”西班牙大流感”，根據(jù)歷史記載，當(dāng)年全世界至少有2500-4000萬(wàn)人死于這次大流行[5]。乙型流感病毒對(duì)人類也有比較強(qiáng)的致病性，但是到目前為止還沒有發(fā)現(xiàn)因乙型流感病毒而引起的大流行；丙型流感病毒到目前為止只引起人類輕微的上呼吸道感染，相對(duì)來(lái)說(shuō)也比較穩(wěn)定，所以也就很少造成流行。由于流感病毒非常容易發(fā)生變異，導(dǎo)致流行反復(fù)地發(fā)生。當(dāng)出現(xiàn)新毒株，人類免疫水平就會(huì)下降，WHO每年也會(huì)根據(jù)流感病毒的變異規(guī)律推薦出用于下一年疫苗生產(chǎn)用流感病毒毒株，因此每年人們都有必要來(lái)接種流感疫苗[6-8]。

在我國(guó)，目前廣泛使用的是流感病毒在雞胚尿囊腔中生長(zhǎng)的方式來(lái)制備流感疫苗（組分包含甲1型、甲3型以及乙型病毒的三價(jià)裂解疫苗）。所以，生產(chǎn)中使用的雞胚質(zhì)量如何，是否能達(dá)到各項(xiàng)要求就顯得十分的重要了。本人所在的公司流感疫苗生產(chǎn)所用胚蛋為海蘭白父母代，而近些年由于禽流感疫情經(jīng)常發(fā)生，所以從2013年開始國(guó)內(nèi)海關(guān)禁止從國(guó)外引進(jìn)活禽，何時(shí)解除禁令不得而知，2017年本公司流感疫苗生產(chǎn)用海蘭白父母代雞胚蛋將無(wú)貨供應(yīng)，同時(shí)國(guó)內(nèi)的公司這幾年來(lái)通過不斷的努力也研發(fā)培育出了不錯(cuò)的種雞和胚蛋，所以一方面為了降低禽流感的風(fēng)險(xiǎn)，同時(shí)也為了擴(kuò)大本公司流感疫苗生產(chǎn)用胚蛋品種的選擇范圍，2016年對(duì)海蘭白商品代和京白系胚蛋進(jìn)行了試驗(yàn)，海蘭白父母代胚蛋作為對(duì)照。經(jīng)生產(chǎn)部、質(zhì)保部開會(huì)討論，選擇2016年生產(chǎn)的3批甲1型、2批甲3型、2批乙型單價(jià)病毒原液（共7批）進(jìn)行變更驗(yàn)證，3種胚蛋每批原液生產(chǎn)時(shí)各投入約2.5萬(wàn)枚進(jìn)行生產(chǎn)。生產(chǎn)過程中，試驗(yàn)蛋與對(duì)照蛋嚴(yán)格分開，分別完成原液各生產(chǎn)步驟，獨(dú)立形成單價(jià)原液，對(duì)生產(chǎn)工藝各階段與胚蛋質(zhì)量及產(chǎn)品得率相關(guān)的數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)和比對(duì)。

1 材料與方法

1.1 雞胚

原液制備使用的10日齡雞胚由寧波威達(dá)龍禽業(yè)有限公司提供，由上海家禽育種有限公司孵化。

1.2 病毒

3個(gè)流行性感冒病毒毒株A/California/7/2009（甲1型）、A/Hongkong/4801/2014（甲3型）、B/Brisbane/60/2008（乙型），由英國(guó)國(guó)家生物制品檢定所（NIBSC）提供。

1.3 設(shè)備及儀器

TKA自動(dòng)胚蛋接種機(jī)、TKA自動(dòng)尿囊液收獲機(jī)、Millipore超濾系統(tǒng)、MettlerToledo DM40密度計(jì)、日立CP80WX超速離心機(jī)、金達(dá)HD-93-1核酸蛋白檢測(cè)儀、Beckman J6離心機(jī)。

1.4 接種

用含有最終濃度為500 9g/ml硫酸慶大霉素的0.01mol/L的PBS溶液稀釋毒種。將胚蛋放到接種機(jī)上，每胚接種病毒。接種了病毒的胚蛋置孵，房孵育50-60小時(shí)。

1.5 收獲

用檢蛋器檢查已經(jīng)孵育到期的胚蛋，去除死胚、雞胚生長(zhǎng)不良、胚蛋污染等不合格的胚蛋。然后將合格的胚蛋移入冷庫(kù)冷卻。冷卻到期后將胚蛋放置于收獲機(jī)上，收獲尿囊液的同時(shí)檢查是否有不合格胚蛋，收獲合格胚蛋的尿囊液。

1.6 濃縮

通過Millipore超濾系統(tǒng)對(duì)收獲尿囊液進(jìn)行濃縮，濃縮后的尿囊液通過MilliporePellicon-2超濾系統(tǒng)進(jìn)一步濃縮，然后加入PB溶液后繼續(xù)濃縮并回收。最后回收的濃縮尿囊液量控制在原收獲尿囊液液量的1/30至1/40。

1.7 純化

量取濃縮后的尿囊液并倒入燒杯內(nèi)，通過蠕動(dòng)泵把樣品導(dǎo)入?yún)^(qū)帶轉(zhuǎn)頭。同樣的方法依次導(dǎo)入30-33_%w/w飛蔗糖溶液、55-56_%w/w蔗糖溶液，當(dāng)轉(zhuǎn)頭中心孔硅膠管流出樣品時(shí)，停止導(dǎo)入55-56%訣幾蔗糖溶液。量取0.125 mol/L的PB溶液，通過蠕動(dòng)泵把PB溶液從中心孔導(dǎo)入?yún)^(qū)帶轉(zhuǎn)頭內(nèi)。設(shè)定離心速度開始離心。離心結(jié)束后收集病毒液。

1.8 裂解及滅活

用0.25_mol/L的PB溶液回收稀釋，使裂解前病毒液蛋白質(zhì)含量在600-900_μg/ml范圍內(nèi)。將病毒液導(dǎo)入裂解罐，加入10_%w/v，聚山梨酯80溶液，攪拌。加入與裂解前病毒液等量的乙醚，攪拌。將病毒裂解液分裝于離心瓶中并離心。離心好之后加入4甲醛，使其最終濃度為80_μg/ml。于2-8℃放置18小時(shí)。

1.9 裂解液純化

按照1.7的方法對(duì)病毒裂解液進(jìn)行區(qū)帶離心，離心結(jié)束后收集病毒液。

1.10 透析脫糖

用0.01_mol/L的PBS溶液10倍稀釋病毒液。通過超濾膜包透析去除蔗糖，10倍濃縮后結(jié)束第一次透析。再次用0.01_mol/L的PBs溶液10倍稀釋，進(jìn)行第二次透析。

1.11 除菌過濾

壓濾桶內(nèi)倒入一定量0.01_mol/L的PBS溶液，使PBS溶液依次通過澄清過濾濾膜和除菌濾膜。將待濾樣品倒入壓濾桶，使樣品依次通過澄清過濾濾膜和除菌濾膜。等待濾樣品過濾完后，在壓濾桶內(nèi)倒入適量0.01_mol/L的PBS溶液清洗濾膜，清洗液體和之前的病毒液都通過濾膜收集在收液瓶?jī)?nèi)，并加入已除菌過濾的4_%w/v甲醛溶液。

2 結(jié)果

數(shù)據(jù)匯總（數(shù)據(jù)為平均值）見表1。

3 討論

本次胚蛋變更驗(yàn)證試驗(yàn)，每批試生產(chǎn)同時(shí)投入三種胚蛋進(jìn)行平行比對(duì)，三種胚蛋來(lái)源均符合企標(biāo)要求，使用的流感毒種一致，生產(chǎn)過程使用的原輔材料均一致。病毒接種、收獲、濃縮工段使用同一套設(shè)備，所以在生產(chǎn)時(shí)間上進(jìn)行了分割，前一種胚蛋相關(guān)生產(chǎn)清場(chǎng)后，再開始后一種胚蛋的相關(guān)生產(chǎn)。純化和裂解液純化兩個(gè)工段所使用的部分離心機(jī)都是相同型號(hào)的離心機(jī)。綜上，我們認(rèn)為三種胚蛋所對(duì)應(yīng)的原液數(shù)據(jù)是客觀的。

對(duì)比表1數(shù)據(jù)，在10日齡尿囊液量、胚蛋合格率、原液得率、原液血凝素含量、原液蛋白質(zhì)含量的數(shù)據(jù)中海蘭白商品代的數(shù)據(jù)是最高的，京白系胚蛋在胚蛋合格率、原液得率、原液血凝素含量、原液蛋白質(zhì)含量上高于海蘭白父母代（對(duì)照品），三者的內(nèi)毒素含量也無(wú)太大差異，因此，我們認(rèn)為兩種候選胚蛋（海蘭白商品代、京白系）都可以用于2017年的流感病毒疫苗生產(chǎn)。

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