紅豆杉AFLP分子標(biāo)記技術(shù)體系的建立及應(yīng)用

史正文

（山西藥科職業(yè)學(xué)院，山西 太原 030031）

紅豆杉（Taxus）又名紫杉，為紅豆杉科紅豆杉屬植物，是多年生小喬木或灌木，在我國云南、江西、福建以及東北等地都有栽培和野生。紅豆杉在全世界共有11種，我國擁有其中4種和1個變種，即中國紅豆杉（Taxus chinensis）、云南紅豆杉（Taxus yunnanensis）、西藏紅豆杉（Taxus wallichinana）、東北紅豆杉（Taxus cuspidata）、南方紅豆杉（Taxus chinensis var.maire）[1]，其中，中國紅豆杉、南方紅豆杉為我國所特有。從紅豆杉的樹皮、樹根及枝葉中提取的紫杉醇具有很強(qiáng)的抗癌能力，是重要的天然抗癌藥物，尤其在治療乳腺癌、肺癌和卵巢癌等方面療效顯著[2]。因此，作為藥源植物的紅豆杉的種質(zhì)資源遺傳多樣性研究和種質(zhì)資源的鑒定就顯得非常重要。

擴(kuò)增片段長度多態(tài)性技術(shù)（AFLP）是由VOS等[3]發(fā)展起來的一種高效分子標(biāo)記技術(shù)，具有技術(shù)穩(wěn)定、分辨率高、重復(fù)性強(qiáng)、可靠性好等特點(diǎn)[4-6]。AFLP被廣泛應(yīng)用于蔬菜[7-9]、林木[10-11]、果樹[12]、糧食作物[13]、牧草[14]等農(nóng)作物的遺傳多樣性分析。

紅豆杉屬植物次生代謝產(chǎn)物較多，總基因組DNA提取較難[15]。AFLP分析對供試DNA的要求較高[16]，所以，提取高分子量、高純度的DNA是AFLP分析成功的關(guān)鍵之一。

本研究以來自不同種源的紅豆杉為材料，通過優(yōu)化AFLP反應(yīng)體系各關(guān)鍵影響因素，建立適合紅豆杉的AFLP分子標(biāo)記體系，為紅豆杉的種質(zhì)資源遺傳多樣性研究和種質(zhì)資源的鑒定奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 植物材料 植物樣品為硅膠干燥后的紅豆杉葉片，來自紅豆杉屬的4個種源和1個變種，樣品保存于山西藥科職業(yè)學(xué)院藥用植物實驗室。每個種源5個單株的等量葉片混合，用于提取基因組DNA。

1.1.2 主要試劑 RNA酶，Taq DNA聚合酶，限制性內(nèi)切酶 EcoRI與 MseI，T4DNA 連接酶，dNTP，DL2000 bp DNA Marker等購自上海生工生物技術(shù)公司。

1.2 DNA的提取

本研究采用改良后的CTAB法提取紅豆杉基因組DNA，紫外分光光度法、瓊脂糖凝膠電泳法檢測其純度和濃度。具體步驟為：（1）選取超低溫保存的紅豆杉葉片放于研缽中，加液氮用力研磨使之呈粉末狀，迅速稱取0.2 g材料，置于1.5 mL離心管中，并將離心管置于冰中。（2）在1.5 mL的離心管中加入1 000 μL預(yù)熱的CTAB提取液（含有PVP（聚乙烯吡咯烷酮）和β-巰基乙醇），使材料完全分散；置于65℃水浴鍋中溫浴30 min，每10 min搖勻一次。（3）將溫浴的材料取出，待冷卻至室溫后加500 μL苯酚-氯仿-異戊醇，搖勻10 min，離心10min（13000r/min），將上清液轉(zhuǎn)移至一新的1.5 mL離心管中。（4）重復(fù)步驟（3）一次。（5）將上清液轉(zhuǎn)移到一新的1.5mL離心管中，加入0.5倍體積的NaCl和3倍體積的無水乙醇，沉降DNA，輕輕顛倒2～3次，于-20℃冰箱中靜置30 min，離心10 min（13 000 r/min），棄上清液。（6）用 200 μL的 70%的乙醇和無水乙醇各洗2次，加入0.1倍體積的NaAc和2倍體積的無水乙醇，-20℃放置30 min，離心10 min（13 000 r/min），收集得到 DNA 沉淀。（7）待DNA干燥后，加100 μLTE溶液溶解，測定其濃度，而后保存于-20℃冰箱備用。

1.3 AFLP分析

1.3.1 酶切反應(yīng) 采用MseΙ和EcoRΙ對紅豆杉基因組DNA進(jìn)行雙酶切，37℃酶切6 h，70℃加熱15 min終止酶切反應(yīng)，將反應(yīng)管置于冰上，電泳檢測酶切完全后可進(jìn)入連接反應(yīng)。

1.3.2 連接反應(yīng) 將連接體系與酶切體系混合（共40 μL），20℃連接過夜，得到的連接產(chǎn)物稀釋5倍后作為下一步預(yù)擴(kuò)增的模板。

1.3.3 預(yù)擴(kuò)增 用具有一個選擇性堿基的引物對連接產(chǎn)物進(jìn)行預(yù)擴(kuò)增。預(yù)擴(kuò)增程序：94℃變性30 s，56℃退火1 min，72℃延伸1 min，20個循環(huán)。預(yù)擴(kuò)增產(chǎn)物稀釋50倍后用于選擇性AFLP擴(kuò)增反應(yīng)。

1.3.4 選擇性擴(kuò)增 確定多態(tài)性較好的6對引物進(jìn)行 PCR：94 ℃ 30 s，65 ℃ 30 s，72 ℃ 60 s一次循環(huán)，然后每循環(huán)一次，其退火溫度降低1℃，執(zhí)行11個循環(huán)。在第一階段11個循環(huán)以后，94℃30 s，56℃30 s，72℃60 s下執(zhí)行23個循環(huán)后終止反應(yīng)，得到的選擇性擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行電泳檢測，確認(rèn)有條帶出現(xiàn)后，進(jìn)入聚丙烯酰胺凝膠電泳。

2 結(jié)果與分析

2.1 紅豆杉DNA的提取

本研究采用改良的CTAB法提取紅豆杉基因組DNA，提取方法主要進(jìn)行了以下改進(jìn)：（1）在CTAB中加人PVP（聚乙烯吡咯烷酮）和β-巰基乙醇聯(lián)合除酚。（2）采用高鹽沉淀法代替了異丙醇沉淀法，高鹽沉淀法更適合紅豆杉基因組DNA的提取。（3）采用多次洗滌和高鹽沉淀法相結(jié)合的方法，以達(dá)到除去多糖的目的。用乙醇沉淀DNA之前，加入0.5倍體積的5 mol/LNaCl；再次溶解洗滌后，用0.1倍體積的3 mol/L NaAc和2倍體積的無水乙醇沉淀DNA。紫外分光光度法檢測所提取基因組DNA的純度，OD值在1.637～1.857。經(jīng)1.5%的瓊脂糖凝膠電泳檢測（圖1），用改良后的CTAB法提取的紅豆杉DNA完整，無降解，能滿足AFLP分子標(biāo)記分析的需要。

2.2 AFLP程序的優(yōu)化

在高質(zhì)量DNA的基礎(chǔ)上，優(yōu)化了AFLP反應(yīng)體系。其中，酶切反應(yīng)體系、PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系列于表 1，2。

表1 酶切連接反應(yīng)體系

表2 預(yù)擴(kuò)增和選擇性擴(kuò)增反應(yīng)體系

同時，改進(jìn)了聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測的方法。具體改進(jìn)的步驟為：（1）用6%的凝膠進(jìn)行電泳檢測。（2）在銀染的過程中，使用超純水可獲得較好的效果；同時要用高純度的氫氧化鈉洗滌，但時間不宜過長，洗滌時間太長，銀顆粒會脫離DNA；染色及顯影溶液臨用前加入甲醛，不能提前加入。

2.3 利用AFLP分子標(biāo)記對紅豆杉進(jìn)行鑒定

用8個EcoRΙ引物和8個MseΙ引物組成的64對引物組合對紅豆杉的供試樣品進(jìn)行擴(kuò)增，篩選出多態(tài)性較好的6對引物對紅豆杉的供試樣品進(jìn)行AFLP分析（表3），6%聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測結(jié)果。結(jié)果表明，所采用的6對引物組合中，每對引物組合擴(kuò)增結(jié)果在不同的紅豆杉的供試樣品中表現(xiàn)出豐富的多態(tài)性（表4）。從表4可以看出，第1號引物組合E-ACC/M-CTC產(chǎn)生的條帶最多，其中，62.5%的條帶為多態(tài)性條帶；第6號引物組合E-AGG/M-CAA產(chǎn)生的條帶最少，多態(tài)性檢出率最低，為47.6%。所選6對引物共獲得總條帶數(shù)323條，平均每對引物產(chǎn)生約54條AFLP帶，176條均為多態(tài)性條帶，多態(tài)性檢出率為54.5%。

表3 選擇性擴(kuò)增的引物序列

表4 紅豆杉AFLP分析多態(tài)性情況

3 結(jié)論與討論

AFLP技術(shù)多態(tài)性豐富、靈敏度高、DNA用量少，但對DNA的純度要求較高。紅豆杉的葉片組織含有大量的多糖、多酚及其他次生代謝產(chǎn)物，用CTAB常規(guī)方法獲得的DNA純度不高，影響了DNA的酶切和PCR效果。本研究采用改良后的CTAB法，采用PVP（聚乙烯吡咯烷酮）和β-巰基乙醇聯(lián)合除酚、高鹽沉淀提取紅豆杉基因組DNA，結(jié)果表明，利用該方法得到的基因組DNA，其質(zhì)量能夠滿足AFLP的要求。

在AFLP分子標(biāo)記分析過程中，PCR反應(yīng)體系中各個成分的濃度要根據(jù)不同物種進(jìn)行調(diào)整。本研究在對不同濃度成分組合進(jìn)行試驗后，得到了一個適合紅豆杉的穩(wěn)定反應(yīng)體系。聚丙烯酰胺凝膠電泳分析表明，預(yù)擴(kuò)增用1個選擇性堿基，選擇性擴(kuò)增用3個選擇性堿基，得到的條帶數(shù)目適中，適合紅豆杉AFLP分析。在聚丙烯酰胺凝膠電泳體系中，凝膠的銀染很重要，銀染步驟不適合，得到的條帶不清晰，通過反復(fù)實踐，建立了一個優(yōu)良的銀染體系。

同時，應(yīng)用建立的AFLP體系，篩選出6對引物組合，在5個紅豆杉種源中共擴(kuò)增出323條條帶，檢測到176個多態(tài)性位點(diǎn)。這些多態(tài)性分子標(biāo)記為進(jìn)一步研究紅豆杉不同種源間的遺傳差異，保護(hù)及開發(fā)、利用紅豆杉資源奠定了基礎(chǔ)。