大白菜轉(zhuǎn)基因選擇劑卡那霉素的濃度篩選

齊仙惠，李梅蘭，巫東堂，李改珍，趙軍良

（1.山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜研究所，山西 太原 030031；2.山西農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院，山西 太谷 030801）

大白菜（Brassica rapa subsp.pekinensis）屬十字花科蕓薹屬植物，又稱結(jié)球白菜、包心白菜、黃芽白、膠菜等，是一種原產(chǎn)于我國(guó)的蔬菜。其具有抗寒、適應(yīng)性強(qiáng)、味甘等特點(diǎn)，營(yíng)養(yǎng)價(jià)值很高。因此，大白菜的栽培和育種研究越來(lái)越受到人們的關(guān)注[1]。近年來(lái)，植物遺傳轉(zhuǎn)化已成為應(yīng)用生物學(xué)研究的熱門課題，為蔬菜品種的改良開(kāi)辟了一條新途徑。目前，植物遺傳轉(zhuǎn)化中常用的2類選擇劑分別是除草劑類和抗生素類。其中，抗生素類的卡那霉素（Kan）是植物轉(zhuǎn)基因研究中最常用的篩選標(biāo)記[2-3]，已被成功應(yīng)用于黃瓜[4]、煙草[5]、水稻[6]、棉花[7-8]、花生[9]、菊花[10]等植物。由于不同物種和基因型以及外植體材料對(duì)Kan濃度的敏感性存在較大差異[11]，所以，需要針對(duì)具體的研究材料進(jìn)行Kan最佳篩選濃度的確定。

本試驗(yàn)擬研究不同濃度Kan對(duì)7#和9#大白菜幼苗生長(zhǎng)發(fā)育的影響，通過(guò)比較2個(gè)品系在不同處理?xiàng)l件下的種子發(fā)芽率、子葉黃化率、下胚軸長(zhǎng)度和幼苗鮮質(zhì)量等，以篩選出2個(gè)大白菜品系的最佳選擇濃度，旨在為今后篩選轉(zhuǎn)基因大白菜植株奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料與試劑

供試大白菜品系為7#和9#自交系。試驗(yàn)試劑有卡那霉素（上海生工公司）、氯化汞、吐溫（Tween-20，美國(guó)BBI公司）、乙醇。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 培養(yǎng)基配制 試驗(yàn)采用MS基本培養(yǎng)基，以30 g/L蔗糖為碳源，添加6.5 g/L的瓊脂粉，調(diào)節(jié)pH值至5.8，用滅菌鍋在121℃下滅菌20 min。滅菌后待培養(yǎng)基冷卻至50℃左右時(shí)添加Kan，使培養(yǎng)基中 Kan 的終質(zhì)量濃度分別為 0，100，150，175，200，225，250 mg/L。

1.2.2 種子消毒 取7#和9#大白菜種子，分別用無(wú)菌水沖洗干凈后，在無(wú)水乙醇中浸泡1 min，再用無(wú)菌水沖洗3次，然后用0.1%的氯化汞溶液浸泡10 min，其中加一滴Tween-20，最后用無(wú)菌水沖洗5次。消毒后分別播種于含有不同濃度Kan的MS培養(yǎng)基上，每個(gè)處理50粒種子，重復(fù)3次。

1.2.3 培養(yǎng)條件和植株生長(zhǎng)狀態(tài)調(diào)查 將培養(yǎng)基置于培養(yǎng)溫度為（25±1）℃、光照強(qiáng)度為1 500～2 500 lx，光/暗為16 h/8 h的培養(yǎng)室中，待種子萌發(fā)后統(tǒng)計(jì)各處理的發(fā)芽率并觀察幼苗長(zhǎng)勢(shì)；培養(yǎng)7 d后統(tǒng)計(jì)各處理幼苗的子葉黃化率、下胚軸長(zhǎng)、主根長(zhǎng)、側(cè)根數(shù)以及幼苗鮮質(zhì)量。下胚軸的長(zhǎng)度為下胚軸基部至芽頂端的長(zhǎng)度，主根的長(zhǎng)度為下胚軸基部至主根尖端的長(zhǎng)度，側(cè)根數(shù)為根長(zhǎng)大于1 cm的第1側(cè)根數(shù)。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

采用SAS軟件對(duì)生長(zhǎng)于不同Kan濃度下的2個(gè)大白菜幼苗的種子發(fā)芽率、子葉黃化率、下胚軸長(zhǎng)、主根長(zhǎng)、側(cè)根數(shù)以及幼苗鮮質(zhì)量進(jìn)行方差分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同質(zhì)量濃度Kan對(duì)種子發(fā)芽率及子葉黃化率的影響

將7#和9#大白菜種子接種到含Kan的培養(yǎng)基中，培養(yǎng)3 d后，種子陸續(xù)發(fā)芽。由統(tǒng)計(jì)結(jié)果可知（表1），除個(gè)別種子外，2個(gè)品種中幾乎所有的種子都能正常萌發(fā)，說(shuō)明Kan的不同濃度對(duì)大白菜種子的萌發(fā)基本沒(méi)有影響。

表1 不同質(zhì)量濃度Kan對(duì)7#和9#種子發(fā)芽率和子葉黃化率的影響 %

培養(yǎng)7 d后，在不含Kan的培養(yǎng)基中，7#和9#的幼苗生長(zhǎng)健壯，沒(méi)有出現(xiàn)子葉黃化現(xiàn)象。在添加了Kan的培養(yǎng)基中，隨著Kan質(zhì)量濃度的增加，子葉黃化率明顯增加，并有部分幼苗因黃化嚴(yán)重而死亡（圖1）；當(dāng)Kan質(zhì)量濃度為175 mg/L時(shí)，7#和9#大白菜的黃化率分別為91.89%和83.72%；當(dāng)質(zhì)量濃度為225 mg/L時(shí)，二者的子葉黃化嚴(yán)重，黃化率分別為100%和97.22%；當(dāng)質(zhì)量濃度為250 mg/L時(shí)，二者的黃化率均高達(dá)100%（表1）。

2.2 不同質(zhì)量濃度Kan對(duì)幼苗生長(zhǎng)的影響

幼苗在不含Kan的培養(yǎng)基中培養(yǎng)7 d后，植株生長(zhǎng)健壯，子葉充分展開(kāi)，大而濃綠，下胚軸正常生長(zhǎng)，根系發(fā)達(dá)，側(cè)根較多（圖2）。其中，7#和9#的下胚軸長(zhǎng)分別為3.13，1.76 cm，主根長(zhǎng)分別為8.73，8.90 cm，分別具有 7.30，5.57條側(cè)根（表 2，3）。

在添加Kan的培養(yǎng)基中，2個(gè)品種的子葉伸展不充分，小而發(fā)黃，植株矮化嚴(yán)重，下胚軸和主根明顯短縮，根系不發(fā)達(dá)，沒(méi)有側(cè)根（圖2）。隨著Kan質(zhì)量濃度的增加，7#和9#幼苗的下胚軸長(zhǎng)和主根長(zhǎng)、鮮質(zhì)量均呈下降趨勢(shì)，且顯著小于對(duì)照植株 （表2，3）。

表2 不同質(zhì)量濃度Kan對(duì)7#大白菜幼苗生長(zhǎng)的影響

表3 不同質(zhì)量濃度Kan對(duì)9#大白菜幼苗生長(zhǎng)的影響

2.3 最佳Kan篩選濃度的確定

利用Kan作為選擇劑，一般要求其既能有效抑制非轉(zhuǎn)化細(xì)胞的生長(zhǎng)，使之緩慢死亡，又不影響轉(zhuǎn)化細(xì)胞的正常生長(zhǎng)[12]。本試驗(yàn)中，100～250 mg/L的Kan均能有效抑制7#和9#大白菜幼苗的生長(zhǎng)。其中，7#大白菜，在100 mg/L的Kan質(zhì)量濃度下，子葉黃化率偏低（78.39%）；在200 mg/L的質(zhì)量濃度下則偏高（97.33%）；在150，175mg/L的質(zhì)量濃度下，子葉黃化率差異不顯著，均在90%左右，因此認(rèn)為，7#大白菜的最佳篩選質(zhì)量濃度為150～175 mg/L。大白菜9#，在175 mg/L的Kan質(zhì)量濃度下，子葉黃化率偏低（83.72%）；在225 mg/L的質(zhì)量濃度下則偏高（97.22%），因此認(rèn)為，9#大白菜的最佳篩選質(zhì)量濃度為200 mg/L。

3 討論

張麗華等[13]對(duì)4個(gè)加工番茄品種的Kan抗性進(jìn)行了篩選，結(jié)果顯示，不同部位對(duì)Kan的敏感度不同：幼苗對(duì)Kan比子葉外植體敏感，而子葉外植體又比下胚軸外植體敏感。在本試驗(yàn)中，Kan對(duì)根長(zhǎng)、下胚軸和植株鮮質(zhì)量的增加均有負(fù)面影響，且對(duì)根長(zhǎng)的影響比對(duì)下胚軸和鮮質(zhì)量的影響大，可能是由于植株的不同部位對(duì)Kan的敏感性不同，也可能與根系直接生長(zhǎng)在培養(yǎng)基中有關(guān)[14]。而2個(gè)品系大白菜種子的萌發(fā)并未受到Kan的影響，各濃度處理下的種子均表現(xiàn)出與對(duì)照組基本一致的發(fā)芽率，這可能是由于有種皮的保護(hù)導(dǎo)致其對(duì)Kan的敏感性較差，以及其只接觸培養(yǎng)基表面的原因。

Kan已被廣泛應(yīng)用于遺傳轉(zhuǎn)化的選擇上，利用合適濃度的Kan進(jìn)行轉(zhuǎn)化植株的篩選非常關(guān)鍵。篩選濃度太高，會(huì)影響轉(zhuǎn)化種子發(fā)育為正常植株，篩選濃度太低又會(huì)有太多的逃逸體，從而加大后期鑒定工作的強(qiáng)度。不同物種和基因型對(duì)Kan濃度的敏感性有差異。張甲佳等[9]對(duì)4個(gè)花生品種的Kan敏感性進(jìn)行了研究，結(jié)果表明，不同品種的花生胚小葉對(duì)Kan的敏感性差異較大，其中，D16的Kan敏感性最高，臨界質(zhì)量濃度為100 mg/L；其次是J11和魯花11，臨界質(zhì)量濃度均為150 mg/L；而花育22的敏感性最低，臨界質(zhì)量濃度達(dá)到200 mg/L。張靜等[15]研究也認(rèn)為，Kan對(duì)蘿卜種子萌發(fā)及生長(zhǎng)發(fā)育有明顯的抑制作用，隨著Kan濃度的升高，致死率升高，主根和下胚軸長(zhǎng)度變短。且不同品種對(duì)Kan的敏感性不同，在經(jīng)Kan溶液浸泡后播種時(shí)，07Lb36-9和07Lb39的Kan致死濃度分別為150，300 mg/L。本試驗(yàn)中，7#和9#大白菜對(duì)Kan的敏感性也有所不同，其中，7#比9#敏感性高，故其所需的最適篩選濃度較低。但在大白菜遺傳轉(zhuǎn)化試驗(yàn)中，不同品種的抗性濃度仍需進(jìn)一步研究。

4 結(jié)論

本試驗(yàn)利用不同濃度的Kan對(duì)7#和9#大白菜進(jìn)行處理，觀察子葉期幼苗生長(zhǎng)情況并進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析，研究結(jié)果顯示，隨著Kan濃度的增加，大白菜種子的萌發(fā)沒(méi)有受到影響，但子葉的黃化率隨之增加，下胚軸和主根的長(zhǎng)度變短，鮮質(zhì)量減輕，側(cè)根數(shù)減少。此外，不同大白菜品系對(duì)Kan的敏感程度不同，7#大白菜的Kan最佳篩選質(zhì)量濃度為150～175 mg/L，9#大白菜則為200 mg/L。這些結(jié)果可為其他大白菜品種的抗性濃度篩選提供參考。