當歸六黃湯對非肥胖性糖尿病小鼠胰島炎和Bax、Bcl-2表達的影響?

庹玲玲，劉 暢，全毅紅

(華中科技大學(xué)附屬武漢中心醫(yī)院中醫(yī)科，武漢 430014)

l型糖尿病(type 1 diabetes mellitus，T1DM)常見于青少年兒童，是所有糖尿病中最為嚴重的一類[1]。有研究表明，T1DM發(fā)生前可能存在一段相對較長的臨床前期[2-3]，若能在此時給予有效干預(yù)措施，將可能延緩甚至預(yù)防顯性糖尿病的發(fā)生，提高患者生活質(zhì)量。

現(xiàn)代醫(yī)學(xué)發(fā)現(xiàn)，當歸六黃湯在T1DM的治療方面具有顯著效果，能緩解患者口渴、多飲、多尿及體質(zhì)量下降等癥狀[4-5]，但其作用機制尚未明確。國內(nèi)學(xué)者宋春雨等[6]在研究中發(fā)現(xiàn)，T1DM的發(fā)生發(fā)展機制與胰島細胞凋亡有密切關(guān)系。國外學(xué)者Liu等[7]亦提出，當歸六黃湯的某些作用與機體免疫反應(yīng)及炎癥因子相關(guān)。bax基因是人體重要的凋亡基因，bcl-2具有抑制凋亡的作用，Bax/Bcl-2 表達蛋白的比例則是決定細胞凋亡抑制作用強弱的關(guān)鍵[8-9]?？梢姡琤ax、bcl-2與胰島細胞凋亡、胰島素分泌可能存在某種關(guān)聯(lián)。因此，筆者欲研究通過糖尿病動物模型，探索不同劑量下當歸六黃湯對非肥胖型糖尿病的預(yù)防效果及可能機制，為糖尿病的治療與預(yù)防尋找一個潛在靶點。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 實驗動物與分組 50只6周齡清潔級雄性NOD小鼠，北京HFK生物科技有限公司提供，飼養(yǎng)于同濟醫(yī)學(xué)院實驗動物中心，控制溫度23±2 ℃，適應(yīng)性喂養(yǎng)7 d。喂養(yǎng)后平均體質(zhì)量(17.6±1.2)g,按隨機數(shù)字表法分為模型組、陽性藥組、研究藥物組(包括低劑量組L組、中劑量組M組、高劑量組H組)5組各10只。

1.1.2 實驗藥物 當歸六黃湯由武漢市中心醫(yī)院中醫(yī)科提供(批號20140910)，將當歸、生地、熟地、黃芩、黃連、黃柏、黃芪以1∶1∶1∶1∶1∶2比例煎水濃縮為0.13 g/ml的母液。參考《中國藥典》相關(guān)資料，高效液相色譜法(HPLC)進行質(zhì)量控制。根據(jù)預(yù)實驗結(jié)果，L組藥物濃度為0.25 g/kg，M組藥物濃度為1.25 g/kg，H組藥物濃度為2.50 g/kg，而模型組注射生理鹽水，陽性藥組則應(yīng)用二甲雙胍(5.00 mg/kg)。藥物處理均持續(xù)4周，每周5 d。

1.1.3 試劑與試劑盒 羅氏微量血糖分析儀購于美國羅氏公司；胰島素酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA) 試劑盒由北京優(yōu)尼康生物科技有限公司提供；Bcl-2和Bax免疫組化試劑盒購自美國Bioworld Technology公司。

1.2 后續(xù)處理及觀察

按上述干預(yù)措施培養(yǎng)4周后，每組隨機抽取3只小鼠進行口服葡萄糖耐量試驗(OGTT)、血清胰島素檢測、胰島炎病理分析、Bax及Bcl-2的檢測。余下小鼠每周監(jiān)測血糖水平，直到26周齡后統(tǒng)計小鼠糖尿病的發(fā)生率。采用血糖儀測尾靜脈血糖，連續(xù)2周血糖高于16.7 mmol/L即可診斷糖尿病。

1.2.1 口服葡萄糖耐量試驗(OGTT) 11周齡小鼠禁食一夜后，2 g/kg葡萄糖灌胃進行OGTT。分別于0、15 min、30 min、60 min、90 min、120 min尾靜脈取血用血糖儀測定血糖值，重復(fù)測量3次，取其平均值。

1.2.2 血清胰島素水平檢測 采用ELISA雙抗體夾心法檢測胰島素水平；取各組小鼠血清，按說明書稀釋后加入微量反應(yīng)板中，同時加入酶結(jié)合物50 μL，于37 ℃恒溫條件下孵育30 min(同時做空白孔、陰性對照孔及陽性對照孔)棄液體，先后加入新鮮稀釋的酶標抗體與底物顯色液，反應(yīng)20 min后終止液終止反應(yīng)；空白孔調(diào)零，酶標儀讀數(shù)，取波長450 nm測量各孔吸光度(OD)值，將各組動物血清OD值帶入標準曲線多項式二次回歸方程中，計算各組動物胰島素濃度乘以稀釋倍數(shù)為實際濃度。

1.2.3 胰腺組織學(xué)觀察 小鼠處死后立即取出胰腺，置于10%中性福爾馬林固定8～12 h，80%乙醇保存，后石蠟包埋、切片、脫蠟、常規(guī)染色、脫水，封片后選取3位不同病理專業(yè)人員分別進行胰腺炎組織學(xué)觀察。隨機觀察每只小鼠胰腺的10個胰島并進行胰島炎分級計分。胰島炎分級計分如下：1分：正常胰島；2分：僅有胰島周圍血管/導(dǎo)管浸潤，未侵入內(nèi)部；3分：浸潤至胰島內(nèi)，但浸潤程度<25%；4分：浸潤程度<50%；5分：浸潤程度>50%。

1.2.4 胰腺組織中Bax及Bcl-2免疫組化測定 小鼠取出胰腺組織用OCT包埋、石蠟切片，于室溫下進行干燥和固定。加入單抗稀釋液，室溫孵育60 min；PBS清洗浸于0.03%H2O2-PBS溶液中，靜置20 min；加入50ul稀釋(1∶100)后的ABS，室溫下孵育30 min，后加入50ul DAB(0.5 mg/ml)，顯色5 min后封片。每只小鼠選取結(jié)構(gòu)、染色清晰的切片，隨機觀察5個視野(×400)，分析Bax及Bcl-2的表達情況。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 19.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計分析，采用重復(fù)測量方差分析比較各組小鼠OGTT結(jié)果在不同時間點下的差異，以探索不同處理措施及不同劑量條件下各組小鼠糖耐量變化；定量資料采用單因素方差分析，兩兩比較采用SNK-q檢驗，定性資料采用χ2檢驗，各組胰島炎評分分布狀況采用Kruskal-Wallis秩序和檢驗加以分析，以探索當歸六黃湯對糖尿病的預(yù)防效果。t檢驗分析Bax及Bcl-2表達水平，P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組小鼠OGTT試驗結(jié)果比較

表1顯示，OGTT試驗結(jié)果顯示各組血糖值隨時間呈先上升后下降趨勢，其最大值均出現(xiàn)在灌胃15 min后隨后下降，于灌胃后120 min恢復(fù)正常水平，此時血糖值與試驗開始前相近。比較不同時間點下各組血糖值，可發(fā)現(xiàn)試驗前與試驗120 min后各組血糖水平比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義；而在灌胃后15 min、30 min、60 min與模型組比較，陽性藥組、M組、H組的血糖值明顯下降(P<0.05)，其中H組血糖水平下降幅度最大(P<0.05)。進一步組間比較，陽性藥組、M組、H組整體血糖值顯著低于模型組(P<0.05)，H組整體血糖水平最低(P<0.05)。

2.2 各組小鼠血清胰島素水平比較

表1 各組OGTT結(jié)果差異比較

表2顯示，比較不同措施干預(yù)后各組小鼠胰島素水平的變化，結(jié)果顯示5組小鼠胰島素水平存在差異(F=21.102，P=0.014)；兩兩比較可知，陽性藥組、M組、H組均顯著高于模型組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；與陽性藥組比較，M組胰島素水平相當(P>0.05)，而H組胰島素水平較高(P<0.05)；藥物劑量組比較，H組胰島素水平最高(P<0.05)，M組次之(P<0.05)。

表2 各組小鼠血清胰島素水平比較

2.3 各組小鼠糖尿病發(fā)病率差異

表3顯示，卡方檢驗分析各組糖尿病發(fā)病率差異，結(jié)果顯示5組發(fā)病率不完全相同，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=9.837，P=0.043)；與模型組比較，陽性藥組、M組及H組糖尿病發(fā)病率明顯下降(P<0.05)；與陽性藥組比較，H組糖尿病發(fā)病率更低(P<0.05)；各劑量組比較，H組發(fā)病率低于M組，M組發(fā)病率顯著低于L組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。

表3 各組小鼠糖尿病發(fā)病率比較

2.4 各組胰島炎評分差異分析

表4顯示，采用Kruskal-Wallis秩和檢驗分析各組胰島數(shù)量及胰島炎評分差異顯示，5組胰島炎評分比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=101.003，P=0.000)；模型組、L組胰島周圍及胰島內(nèi)均可見大量淋巴細胞浸潤，有些胰島的炎癥出現(xiàn)片狀融合，胰島細胞數(shù)量明顯減少甚至完全消失，而陽性藥組、H組、M組中多數(shù)胰島結(jié)構(gòu)完整，胰島細胞清晰可見，僅在周邊有少量細胞浸潤。

表4 各組小鼠胰島炎評分及胰島數(shù)量比較

2.5 各組動物細胞Bax、Bcl-2與Bax/Bcl-2表達水平差異

表5圖1顯示，從細胞Bax、Bax/Bcl-2表達水平來看，模型組高于陽性藥組、M組、H組(P<0.05)；陽性藥組Bax、Bax/Bcl-2表達水平顯著高于H組(P<0.05)，但與M組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；各劑量組比較，H組Bax、Bax/Bcl-2表達水平最低(P<0.05)；細胞Bcl-2基因表達水平則與Bax、Bax/Bcl-2表達水平相反。

表5 各組細胞Bax、Bcl-2與Bax/Bcl-2表達水平比較

圖1 各組小鼠胰島光鏡顯示比較(×400)

3 討論

目前國內(nèi)外的研究顯示，T1DM的發(fā)病機制主要包括免疫平衡紊亂及胰島 β 細胞的凋亡，二者涉及多個基因家族及信號傳導(dǎo)通路[10-11]，最終導(dǎo)致胰島素分泌減少，促使T1DM的發(fā)生。從中醫(yī)角度來看，糖尿病屬于“消渴”“消癉”“消中”等范疇，陰虛內(nèi)熱為其主要病機[12]。當歸六黃湯由當歸、生地黃、熟地黃、黃芩、黃連、黃柏等藥物加1倍的黃芪組成，可作為滋陰瀉火良方[13]。同時，當歸六黃湯中的多數(shù)單味中藥具有顯著抗糖尿病作用。根據(jù)目前糖尿病動物模型初步研究結(jié)論，其作用極可能與抗胰島細胞凋亡作用相關(guān)。國內(nèi)學(xué)者常曉[14]的研究結(jié)論亦與此一致。因此，本實驗通過探究不同劑量下當歸六黃湯對T1DM模型小鼠的作用，分析其可能的作用機制，評估其臨床應(yīng)用價值。

作為一種反映胰島β細胞功能和機體對血糖調(diào)節(jié)能力的葡萄糖負荷試驗，OGTT廣泛應(yīng)用于臨床實踐中，是目前公認的確診糖尿病的金標準[15]。因此，本實驗采用OGTT作為各組小鼠糖耐量檢測指標，判斷干預(yù)措施對小鼠血糖及其胰島功能的影響，其結(jié)果提示當歸六黃湯對T1DM有一定的療效，參照陽性藥組、M組、H組陽性結(jié)果可排出其他因素干擾。進一步分析各劑量組效應(yīng)，結(jié)果提示當歸六黃湯的療效可能與其劑量相關(guān)，劑量增加時，降低血糖程度越明顯。本實驗中，L組作為最低劑量研究組應(yīng)是最大無效劑量，故根據(jù)預(yù)試驗結(jié)果，L組各指標與模型組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義。

重復(fù)測量方差分析結(jié)果提示，當歸六黃湯可能對小鼠胰島細胞有保護作用，可促進胰島素分泌。各劑量組比較，研究藥物劑量增大可加強對胰島細胞的保護作用，胰島素分泌可能與藥物劑量相關(guān)。同時卡方檢驗結(jié)果提示，當歸六黃湯可降低小鼠糖尿病發(fā)病率，可能具有保護胰腺、預(yù)防T1DM的作用，此作用效應(yīng)隨劑量增大而增大。

胰島炎為NOD鼠特征性的病理改變，其輕重程度可反映免疫情況，胰島炎減輕提示NOD鼠自身免疫反應(yīng)在一定程度上受到抑制。本實驗取11周齡小鼠胰腺HE染色，胰島炎分級計分表明，當歸六黃湯可以保護胰島的完整性，降低淋巴細胞浸潤程度，從而抑制胰島炎，增加胰島數(shù)量。

Bax通過與Bcl-2形成異源二聚體，封閉Bcl-2活性，導(dǎo)致細胞凋亡。本實驗檢測各組胰島細胞Bax及Bcl-2蛋白表達，結(jié)果提示當歸六黃湯對NOD小鼠的治療作用可能是通過改變小鼠胰島細胞Bax和Bcl-2基因表達、減少胰島細胞的凋亡實現(xiàn)的。且當歸六黃湯劑量越高，小鼠胰島細胞Bax表達水平越低，Bcl-2表達水平越高提示其作用強弱隨劑量變化而變化，高劑量時作用效應(yīng)顯著增強。

本研究尚有不足，樣本量較小，當歸六黃湯納入研究劑量較少，相關(guān)基因蛋白研究不夠全面。筆者將在日后的研究中，進一步增加試驗動物數(shù)量，盡可能納入更多藥物劑量進行細分研究，探討可能的分子機制及中醫(yī)療效，進一步證實該實驗結(jié)論。

綜上所述，當歸六黃湯可促進NOD小鼠胰島素的分泌，降低糖耐量和糖尿病的發(fā)病率功能，其機制可能與減輕胰島炎癥、降低胰島細胞Bax的表達、增加Bcl-2的表達、抑制胰島細胞凋亡有關(guān)，有望作為臨床治療T1DM患者的輔助藥物之一。