人骨形成因子7基因慢病毒載體的構(gòu)建及其在骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞中的表達(dá)

屈彥純 王愛香 郭嘉寧 王嘉南 楊 闊 朱小泉 楊 澤

作者單位： 1.天津醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院，天津市泌尿外科研究所 3002112.北京醫(yī)院，國家老年醫(yī)學(xué)中心，衛(wèi)生部老年醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 100730

BMP7是TGF-β超家族的一員。研究發(fā)現(xiàn)BMP7在多種生理功能和相關(guān)老年疾病發(fā)生發(fā)展中具有重要的作用，尤其在糖尿病腎臟損傷保護(hù)中是一個關(guān)鍵因素。通過重組BMP7的人工表達(dá)，可以有效逆轉(zhuǎn)高糖腎臟損傷，并促使恢復(fù)正常的腎臟功能。研究發(fā)現(xiàn)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(MSCs)是體內(nèi)分泌BMP7的功能細(xì)胞，近年來糖尿病腎病干細(xì)胞治療已取得了長足進(jìn)展。將干細(xì)胞治療與重組BMP7高表達(dá)結(jié)合起來，必將對糖尿病腎病的治療創(chuàng)新發(fā)展產(chǎn)生推動作用。本研究致力于建立一種高表達(dá)人BMP7的MSCs細(xì)胞系，從而為開發(fā)新的治療途徑奠定基礎(chǔ)。

1.材料和方法

1.1 材料和試劑 大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞DH5α和293 T細(xì)胞系由研究所中心實(shí)驗(yàn)室提供;pCDH慢病毒載體及包裝質(zhì)粒由衛(wèi)生部老年醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室朱小泉博士提供，BMP7外源基因天津科技大學(xué)生物工程學(xué)院刁愛坡教授惠贈;Trizol，RT試劑盒，PCR Mix DNA連接酶購自Takara公司；BamH I，EcoR I，來源于Fermentas公司;慢病毒濃縮試劑盒由Biomiga公司提供;胎牛血清、低糖DMEM、胰酶由Gibco公司提供;一抗來自武漢博士德公司，二抗由北京中杉金橋提供，轉(zhuǎn)染及其他分子生物學(xué)試劑購于Invitrogen公司。

1.2 方法

1.2.1 骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的培養(yǎng)：采用全骨髓培養(yǎng)法，取6周小鼠的股骨和脛骨等長骨，直接用含10%的FBS培養(yǎng)基沖洗，獲得的骨髓細(xì)胞不用離心直接接種在培養(yǎng)瓶里，24～48小時除去懸浮細(xì)胞，48～72小時第一次更換培養(yǎng)基。接下來3～5天更新培養(yǎng)基，直至第一次傳代。一般8～10天以后首次傳代。細(xì)胞爬片免疫組織化學(xué)染色檢測CD44，CD105等干細(xì)胞相關(guān)標(biāo)記物。

1.2.2 pCDH-BMP7慢病毒載體的構(gòu)建與鑒定：PCR擴(kuò)增BPMP7全長基因，根據(jù)Genbank 中BMP7(NM_001719)的mRNA序列為模板，設(shè)計特異引物并分別其5’端添加EcoR I和BamH I酶切位點(diǎn)及保護(hù)堿基。引物序列如下：Forward 5‘ CCTAAGCTT-ATG CAC GTG CGC TCA CTG CGA GCT’，Reverse 5‘TTT GGA TC-C CTA GTG GCA GCC ACA GGC CCG GAC CA。PCR條件：94℃ 5分鐘，(94℃ 1分鐘，65℃ 1分鐘，72℃ 1分鐘)×35個循環(huán)，72℃ 7分鐘，檢測產(chǎn)物大小為1314bp。RT-PCR 產(chǎn)物以EcoR I和BamH I雙酶切?；厥盏哪康钠闻cpCDH慢病毒骨架載體連接過夜。次日連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)入感受態(tài)DH5a,小量抽提質(zhì)粒，送蘇州金唯智生物技術(shù)公司測序。

1.2.3 慢病毒的包裝與滴度測定：轉(zhuǎn)染前1天，將293T 105個細(xì)胞接種于15cm2培養(yǎng)皿中，37℃ 5% CO2過夜培養(yǎng)。取1.5ml Opti-MEM培養(yǎng)基，加入100μl的含有穿梭質(zhì)粒和包裝質(zhì)粒的(pCDH-BMP7:PPA2X2:EMG=5:3:2)慢病毒;另取1.5ml Opti-MEM，加入300μl Lip2000;將上述兩種液體充分混勻，室溫靜置20分鐘。然后轉(zhuǎn)染培養(yǎng)皿中的細(xì)胞，8小時后除去轉(zhuǎn)染液加入新鮮培養(yǎng)液。72小時收集上清，利用Biomiga公司EZgeneTM試劑盒按照標(biāo)準(zhǔn)流程濃縮病毒，-80℃冰箱保存。將293 T細(xì)胞以1×104濃度接種于24孔板，37℃ 5% CO2培養(yǎng)24小時后各孔加入不同濃度梯度的病毒液100μl(10-1、10-2、10-3、10-5)以pCDH-GFP病毒感染293T細(xì)胞染細(xì)胞作為對照組。72小時后通過熒光顯微鏡觀察，計算熒光細(xì)胞數(shù)，并根據(jù)公式TU/μl =(GFP陽性細(xì)胞率×轉(zhuǎn)染細(xì)胞數(shù)/100×每孔加入病毒稀釋液體積)×1/稀釋因子計算出病毒液滴度。

1.2.4 慢病毒感染MSCs：感染前1 天，將處于指數(shù)生長期的MSCs以5×104接種于12孔板中，將待轉(zhuǎn)染細(xì)胞分組:A 組:pCDH-BMP7 轉(zhuǎn)染組;B組:空質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組。次日，將病毒以180倍的感染復(fù)數(shù)(MOI=180)感染細(xì)胞，并加入終濃度5μg/ml的Polybrene增加轉(zhuǎn)染率(B組以同樣方法轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒pCDH-GFP)。24小時更換培養(yǎng)基，48～72小時觀察轉(zhuǎn)染細(xì)胞熒光表達(dá)情況。通過嘌呤霉素(2μg/ml)篩選得到穩(wěn)定擴(kuò)大培養(yǎng)后進(jìn)行基因表達(dá)檢測。

1.2.5 定量RT-PCR檢測BMP7 mRNA 表達(dá)：以TRIzol RNA提取試劑盒提取經(jīng)轉(zhuǎn)染后48小時的MSCs總RNA進(jìn)行RT-PCR反應(yīng)，上游引物為5’-TTCCTCACCGACGCCGACAT-3’ 下游引物為5’-ATCACAGCCACCAGCAACCACT-3’瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產(chǎn)物(若有hBMP7mRNA的表達(dá)則應(yīng)出現(xiàn)328bp DNA片段)。

1.2.6 Western blot 檢測感染后BMP7蛋白的表達(dá)：取病毒感染1周后的MSCs，提取總蛋白，采用BCA法測定蛋白濃度。取20μl 蛋白上樣通過丙烯酰胺凝膠電泳分離，然后將蛋白轉(zhuǎn)到PVDF膜上，以5% 脫脂奶粉封閉2小時，一抗(稀釋至1:500)4℃孵育過夜，加入二抗(稀釋至1:3000)室溫孵育1小時后ECL曝光顯色，條帶灰度值通過BAND LEADER 3.0軟件定量，重復(fù)三次取平均值。

2.結(jié)果

2.1 pCDH-BMP7慢病毒表達(dá)載體的構(gòu)建與鑒定 構(gòu)建的pCDH-BMP7表達(dá)載體經(jīng)EcoR I和BamH I雙酶切后可獲得1302bp的BMP7基因蛋白編碼序列的擴(kuò)增片段，經(jīng)金唯智公司序列測定未發(fā)現(xiàn)基因移碼或點(diǎn)突變，可用于進(jìn)一步的病毒包裝和細(xì)胞感染表達(dá)工作(圖1)。

2.2 慢病毒包裝與滴度測定 慢病毒3種質(zhì)粒共同轉(zhuǎn)染293 T細(xì)胞后，48～72小時后觀察細(xì)胞熒光表達(dá)。構(gòu)建的質(zhì)粒能夠成功感染293 T細(xì)胞。根據(jù)計算公式計算出濃縮后pCDH-BMP7慢病毒病毒液滴度為5×108TU/ml，空質(zhì)粒pCDH-GFP的滴度為3×108TU/ml，能滿足外源基因表達(dá)對病毒滴度的要求。

2.3 慢病毒感染MSCs

2.3.1 骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的培養(yǎng)與鑒定：經(jīng)淋巴細(xì)胞分離液密度梯度離心得到比較一致的球形細(xì)胞。原代培養(yǎng)24小時后細(xì)胞貼壁，其后細(xì)胞開始分裂增殖，形成細(xì)胞團(tuán)。9～12天時細(xì)胞達(dá)95%以上。多次傳代的MSCs接近融合生長時，有更均勻有序的成纖維細(xì)胞樣分布特征(圖2a)。連續(xù)傳4代，細(xì)胞形態(tài)基本穩(wěn)定。免疫組織化學(xué)染色檢測表明小鼠骨髓MSCs表達(dá)CD44和CD105等表面標(biāo)志，基本不表達(dá)造血細(xì)胞表面標(biāo)志CD34，符合MSCs特征(圖2b)。

2.3.2 慢病毒感染MSCs：病毒以180倍感染復(fù)數(shù)(MOI=180)感染小鼠MSCs，24小時更換培養(yǎng)基后細(xì)胞熒光基本不表達(dá)，感染72小時后熒光顯微鏡下可以觀察到明亮的綠色熒光，MSCs細(xì)胞感染率達(dá)到75%以上(見圖2c)。

2.4 定量PCR檢測BMP7基因mRNA的表達(dá) 收獲病毒感染72小時后的MSCs，提取總RNA,反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA通過特異引物擴(kuò)增328bp的特異片段，發(fā)現(xiàn)感染病毒的MSCs BMP7表達(dá)顯著升高，表明外源基因BMP7獲得了穩(wěn)定的高表達(dá)(圖3)。

注：a. pCDH-BMP7雙酶切目的基因片段電泳圖。左泳道為目的片段，右泳道為分子量參照。b. pCDH-BMP7擴(kuò)增引物附近序列測定圖譜，與基因庫序列一致。圖1

注：a.骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞形態(tài)特征(200X)；b.CD44免疫組化染色陽性(100X);c.病毒轉(zhuǎn)染72小時后GFP熒光表達(dá)情況(100X)。圖2

注：a.RT-PCR電泳圖左側(cè)起泳道1～2為BMP7基因轉(zhuǎn)染組，3～4為空質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組，最右側(cè)為分子量參照物；b.實(shí)時定量PCRΔCt值在基因轉(zhuǎn)染組與對照組之間進(jìn)行比較差異極顯著。圖3

2.5 Western blot檢測BMP7蛋白的表達(dá) 提取病毒感染后的各組MSCs 的總蛋白，進(jìn)行Western 雜交檢測，結(jié)果顯示(見圖4 ):pCDH-BMP7轉(zhuǎn)染組高表達(dá)BMP7 蛋白，而pCDH-GFP 空質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組、僅檢測到內(nèi)源本底BMP7蛋白表達(dá)(見表1)。這說明包裝病毒液感染間充質(zhì)細(xì)胞后，能夠穩(wěn)定過表達(dá)外源BMP7蛋白。

注：左側(cè)為BMP7基因轉(zhuǎn)染組BMP7表達(dá)顯著升高。圖4 Western雜交結(jié)果

VariablesControl(m±s.d)Overexpressed(m±s.d)t-valueSig.(p)Mean.d95%CIDensity91.74±7.23195.91±2.8817.96.000104.1891.71～116.65Ratio2.98±0.156.66±0.2319.98.0003.683.24～4.12

3.討論

3.1 骨形態(tài)發(fā)生蛋白-7的結(jié)構(gòu)和功能 BMP-7屬于TGF-β的超家族，其編碼基因cDNA全長l 293 bp，它包含一個開放閱讀框(oRF)，編碼產(chǎn)生的前體蛋白由431個氨基酸構(gòu)成，分為信號肽段、前體肽段和成熟肽段三個部分。作為BMP家族的一員 BMP-7不僅與骨組織發(fā)生、發(fā)育、再生和修復(fù)密切相關(guān)，而且BMP7在多種生理功能和相關(guān)老年疾病發(fā)生發(fā)展中具有重要的作用，尤其在糖尿病腎臟損傷保護(hù)中是一個關(guān)鍵因素。通過重組BMP7的人工表達(dá)，可以有效逆轉(zhuǎn)高糖腎臟損傷，并促使其恢復(fù)正常的腎臟功能。近年來BMP7已經(jīng)成為重要的基因靶點(diǎn)，在糖尿病腎病等疾病的治療康復(fù)中具有重要意義。

3.2 外源性人BMP-7在MSCs中的表達(dá) 骨髓MSCs 在體內(nèi)外增殖能力很強(qiáng)，且具有多分化潛能，是一種理想的基因工程載體細(xì)胞，且在體內(nèi)負(fù)責(zé)分泌天然的BMP7生長因子，目前MSCs治療快速發(fā)展，已日益被人們接受。以骨髓MSCs作為外源BMP7表達(dá)宿主，既有利于外源基因在體內(nèi)的快速增殖，又能保證外源表達(dá)蛋白的天然活性。實(shí)驗(yàn)構(gòu)建了人BMP7的慢病毒表達(dá)載體，并通過慢病毒介導(dǎo)將人BMP-7基因轉(zhuǎn)入小鼠骨髓MSCs中。BMP7 mRNA的表達(dá)是細(xì)胞表達(dá)BMP7多肽蛋白的前提，同時也證明了BMP7基因在MSCs基因組的有效整合。本實(shí)驗(yàn)通過實(shí)時定量RT-PCR和Western blot證實(shí)重組基因慢病毒感染細(xì)胞后能夠表達(dá)外源性BMP7的mRNA和蛋白，從而證實(shí)采用此方法進(jìn)行BMP-7體外表達(dá)是有效的。

3.3 慢病毒載體基因表達(dá)的特點(diǎn) 將外源DNA 導(dǎo)入真核細(xì)胞的方法有瞬時轉(zhuǎn)染與穩(wěn)定轉(zhuǎn)染兩種。瞬時轉(zhuǎn)染中，外源DNA無需整合到宿主染色體，目的基因會隨著細(xì)胞的分裂逐漸丟失;穩(wěn)定轉(zhuǎn)染是將目的基因整合到宿主染色體DNA中，從而建立含有外源基因的細(xì)胞系克隆。研究攜帶外源基因的MSCs移植對糖尿病腎病的療效需要BMP7基因在MSCs中長期穩(wěn)定的表達(dá)。慢病毒載體來源于改造的人類免疫缺陷病毒-1(HIV-1)， 是一種穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的理想載體，其能夠感染分裂或非分裂細(xì)胞，目的基因片段容量大，表達(dá)時間長，且不易引起免疫反應(yīng)。因此，將長為1293 bp 的BMP7基因穩(wěn)定轉(zhuǎn)入MSCs，并建立穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的細(xì)胞系，慢病毒載體是一個非常有力的工具。