基于高通量測(cè)序分析河北省中南部地區(qū)耕地土壤細(xì)菌多樣性

張 翔，宋水山，黃亞麗，賈振華，黃媛媛，宋 聰

(1.河北省科學(xué)院 生物研究所，河北 石家莊 050081；2.河北科技大學(xué) 生物科學(xué)與工程學(xué)院，河北 石家莊 050000；3.河北省主要農(nóng)作物病害微生物控制工程技術(shù)研究中心，河北 石家莊 050081)

河北省地處華北平原，土地總面積188 544.71 km2，其中，耕地面積有6 537.74 km2[1]。河北省平原地區(qū)主要以溫室大棚和大田2種培養(yǎng)方式進(jìn)行種植。溫室大棚是一種不受外界環(huán)境影響、能夠人工調(diào)節(jié)局部環(huán)境條件，來(lái)達(dá)到農(nóng)作物生長(zhǎng)最合適的生態(tài)環(huán)境的種植方式[2]。溫室大棚可以延長(zhǎng)蔬菜的生產(chǎn)時(shí)間，增加土地利用率，提高產(chǎn)量。但是，溫室大棚因?yàn)槠浞忾]性、局限性，使大棚的內(nèi)部長(zhǎng)期處于高溫、高濕的環(huán)境中[3]。這就使得大棚中的土壤會(huì)隨著耕種年限的延長(zhǎng)，出現(xiàn)土壤酸化、鹽漬化、土壤微生物結(jié)構(gòu)失衡、易染病、土壤養(yǎng)分失衡、重金屬和農(nóng)藥化肥積累等問(wèn)題[4-7]，會(huì)嚴(yán)重影響農(nóng)作物的產(chǎn)量。

在溫室大棚生態(tài)環(huán)境中，土壤微生物的群落組成能夠較為準(zhǔn)確地反映大棚土壤的狀態(tài)。土壤微生物種類繁多、結(jié)構(gòu)復(fù)雜，而目前可培養(yǎng)的微生物僅占到了1%～10%，并不能反映土壤微生物的群落結(jié)構(gòu)[8]。最新的MiSeq高通量測(cè)序平臺(tái)可以對(duì)土壤中所有微生物的16S rDNA、18S rDNA及ITS等序列進(jìn)行測(cè)序，并對(duì)土壤中的優(yōu)勢(shì)物種、稀有物種和未知物種進(jìn)行檢測(cè)，分析每個(gè)物種的相對(duì)豐度及微生物群落的組成[9-12]。

目前，對(duì)溫室大棚與露天大田的土壤微生物群落結(jié)構(gòu)的對(duì)比很少有報(bào)道。本研究利用高通量測(cè)序技術(shù)對(duì)河北省中南部地區(qū)的溫室大棚與露天大田的土壤微生物群落結(jié)構(gòu)進(jìn)行對(duì)比分析，旨在進(jìn)一步了解2種種植方式對(duì)土壤微生物群落結(jié)構(gòu)的影響，為改善溫室大棚土壤環(huán)境，提高抗病性，提高農(nóng)作物產(chǎn)量提供依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 樣品采集

試驗(yàn)所用土壤樣品均采集于河北省平原地區(qū)的溫室大棚土壤及其周邊的大田土壤。土壤樣品的收集方法采用5點(diǎn)采樣法，采集深度0～10 cm。樣品取好后放入冰盒中帶回實(shí)驗(yàn)室，并放入-80 ℃冰箱中儲(chǔ)存?zhèn)溆肹13]。

各個(gè)土壤樣品的采集信息見(jiàn)表1。

表1 土壤樣品采集信息(2016年)Tab.1 Soil samples collection information table

1.2 土壤中細(xì)菌總DNA的提取及PCR擴(kuò)增

從帶回的土壤樣品中取0.25 g，利用Mobio公司的Powersoil土壤DNA提取試劑盒進(jìn)行土壤總DNA的提取。DNA提取好后，用通用引物338F(5′-ACTCCTACGGGAGGCAGC-3′)和806R(5′-GGACTA CHVGGGTWTCTAAT-3′)對(duì)土壤中細(xì)菌16S rDNA的V3-V4區(qū)域進(jìn)行PCR擴(kuò)增。

1.3 MiSeq上機(jī)測(cè)序

將純化好PCR產(chǎn)物送去北京奧維森基因科技有限公司，利用 Illumina Miseq 高通量測(cè)序平臺(tái)進(jìn)行測(cè)序和分析。

1.4 數(shù)據(jù)分析

首先，利用Trimmomatic、FLASH、Pear、usearch軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行拼接、質(zhì)控和去除嵌合體。然后，對(duì)拼接好的序列進(jìn)行進(jìn)一步的去除嵌合體和段序列得到優(yōu)質(zhì)序列。接下來(lái)，利用Qiime、uclust、usearch軟件按照97%相似性將全部?jī)?yōu)質(zhì)序列進(jìn)行聚類，得到代表序列和OTU表。利用mothur等軟件進(jìn)行稀釋性曲線的繪制，利用Qiime等軟件計(jì)算Chao1值、observed_species指數(shù)、goods_coverage指數(shù)和Shannon指數(shù)。為了得到每個(gè)OTU的物種信息，采用RDP Classifier算法對(duì)每個(gè)OTU代表序列進(jìn)行比對(duì)分析，并在各個(gè)水平注釋群落物種信息。利用R語(yǔ)言繪制物種組成分析和PCA分析的圖表[14]。

2 結(jié)果與分析

2.1 測(cè)序結(jié)果分析

采集的14個(gè)土壤樣品上機(jī)測(cè)序的數(shù)據(jù)經(jīng)過(guò)過(guò)濾、質(zhì)控、去除嵌合體和段序列等操作后，共得到優(yōu)質(zhì)序列495 124條，平均每個(gè)樣品有35 366條優(yōu)質(zhì)序列(表2)。通過(guò)Qiime軟件按照97%相似度對(duì)所有優(yōu)質(zhì)序列進(jìn)行聚類，一共得到5 821種OTU，平均每個(gè)樣品中有2 640多個(gè)OTU。

表2 各樣品最終序列數(shù)與OTU數(shù)統(tǒng)計(jì)Tab.2 Statistical table of final sequence numberand OTU number of each sample

2.2 土壤樣品測(cè)序深度驗(yàn)證

稀釋性曲線(Rarefaction curve)是從樣本中隨機(jī)抽取一定數(shù)量的個(gè)體，統(tǒng)計(jì)這些個(gè)體所代表的物種數(shù)目，并以個(gè)體數(shù)與物種數(shù)來(lái)構(gòu)建曲線[15]。如圖1所示，當(dāng)曲線趨于平坦時(shí)，說(shuō)明隨著測(cè)序的加深獲得的新物種的量較少。這就可以體現(xiàn)出測(cè)序的深度及測(cè)序的量合理性。

圖1 樣品稀釋曲線Fig.1 Rarefaction curves for samples

同樣，Shannon-Wiener曲線是利用各樣本的測(cè)序量在不同測(cè)序深度時(shí)的微生物多樣性指數(shù)構(gòu)建曲線，如圖2所示，當(dāng)曲線趨于平坦時(shí)，說(shuō)明數(shù)據(jù)量足夠大，可以反映樣本中絕大多數(shù)微生物的信息。

通過(guò)稀釋曲線和Shannon-Wiener曲線，可以看出本次測(cè)序深度足夠，當(dāng)前測(cè)序結(jié)果可以反映出該樣品中的土壤微生物的真實(shí)情況。

圖2 Shannon-Wiener曲線Fig.2 Shannon-Wiener curves for samples

2.3 PCA分析及Anosim分析

PCA分析是一種對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行簡(jiǎn)化分析的技術(shù)。這種技術(shù)主要是對(duì)各個(gè)樣品中的主成分進(jìn)行分析。PCA分析可以反映出樣品間的差異和相對(duì)距離[16]。如圖3所示，大棚組(M1)與大田組(N1)的樣品大部分集中在2個(gè)區(qū)域，并且兩組間相對(duì)距離較遠(yuǎn)，說(shuō)明兩組間差異較大。N1組的幾乎所有樣品的相對(duì)距離都很近，說(shuō)明大田的樣品微生物組成相似度比較高，這可能是由于大田是開(kāi)闊環(huán)境，與外界大環(huán)境交流頻繁，所以相互之間的差異性較小。而M1組的幾個(gè)樣品相對(duì)分散，說(shuō)明大棚樣品間也存在一定的差異性，可能是由于大棚環(huán)境相對(duì)封閉，不可移動(dòng)，以及長(zhǎng)期施肥用藥在土壤中的積累，都會(huì)對(duì)土壤中微生物組成產(chǎn)生很大的影響。

圖3 基于OTU水平的PCA分析Fig.3 PCA analysis based on OTU level

Anosim相似性分析是用來(lái)檢驗(yàn)組間的差異是否顯著大于組內(nèi)差異，從而判斷分組是否有意義[17]。如表3所示，R-value介于(-1，1)之間，R-value大于0，說(shuō)明組間差異顯著。R-value小于0，說(shuō)明組內(nèi)差異大于組間差異。統(tǒng)計(jì)分析的可信度用P-value 表示，P< 0.05 表示統(tǒng)計(jì)具有顯著性。表3中，大棚組與大田組的R-value是0.291 8大于0，說(shuō)明這2組組間差異顯著，而且P-value等于0.001遠(yuǎn)遠(yuǎn)小于0.05，說(shuō)明這2組具有顯著性差異。

通過(guò)PCA分析和Anosim分析，可以看出這2組樣品間存在明顯的差異，說(shuō)明這樣的分組是有意義的。接下來(lái)可以進(jìn)一步對(duì)組間存在的差異進(jìn)行分析。

表3 兩組樣品Anosim分析計(jì)算結(jié)果Tab.3 Anosim analysis and calculation results of two groups

2.4 兩組樣品的物種組成分析

2.4.1 門(mén)水平的物種組成分析 從門(mén)的水平來(lái)看(圖4)，2組樣品中一共比對(duì)出已知菌門(mén)39種。其中，優(yōu)勢(shì)菌門(mén)以及在大棚組和大田組所占的比例分別是變形菌門(mén)(Proteobacteria，39.8%和38.2%)、放線菌門(mén)(Actinobacteria，14.4%和21.4%)、酸桿菌門(mén)(Acidobacteria，12.0%和15.4%)、擬桿菌門(mén)(Bacteroidetes，8.6%和6.9%)、綠彎菌門(mén)(Chloroflexi，7.9%和5.8%)、厚壁菌門(mén)(Firmicutes，4.5%和1.7%)和芽單胞菌門(mén)(Gemmatimonadetes，4.2%和3.7%)這7個(gè)細(xì)菌門(mén)類。在這7個(gè)優(yōu)勢(shì)菌門(mén)中，存在明顯差異的有2個(gè)菌門(mén)。一個(gè)是放線菌門(mén)，在大田組中明顯多于大棚組；另一個(gè)是厚壁菌門(mén)，在大田組明顯少于大棚組。

圖4 門(mén)水平物種組成Fig.4 Species composition in phylum

2.4.2 綱水平的物種組成分析 從綱水平來(lái)看(圖5)，2組樣品中的優(yōu)勢(shì)菌綱一共有15種。這15種優(yōu)勢(shì)菌綱及其在M1和N1這2組中的比例分別是：α-變形菌綱(Alphaproteobacteria，19.4%和19.6%)、酸桿菌綱(Acidobacteria，10.6%和13.9%)、γ-變形菌綱(Gammaproteobacteria，10.6%和6.9%)、放線菌綱(Actinobacteria，8.1%和12.0%)、Δ-變形菌綱(Deltaproteobacteria，5.3%和6.2%)、β-變形菌綱(Betaproteobacteria，4.3%和5.4%)、芽單胞菌綱(Gemmatimonadetes，4.2%和3.7%)、纖維黏網(wǎng)菌綱(Cytophagia，3.7%和2.4%)、桿菌綱(Bacilli，3.5%和1.6%)、Anaerolineae(3.1%和1.3%)、鞘脂桿菌綱(Sphingobacteriia，3.1%和3.4%)、酸微菌綱(Acidimicrobiia，2.8%和3.4%)、嗜熱油菌綱(Thermoleophilia，2.0%和3.6%)、黃桿菌綱(Flavobacteriia，1.7%和0.6%)和全噬菌綱(Holophagae，1.2%和1.4%)。

在上述15種優(yōu)勢(shì)菌綱中，經(jīng)過(guò)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，大棚組與大田組相比相對(duì)豐度明顯增高的是纖維黏網(wǎng)菌綱、桿菌綱和黃桿菌綱等，而相對(duì)豐度明顯降低的是酸桿菌綱和β-變形菌綱等。

圖5 綱水平物種組成Fig.5 Species composition in class

2.4.3 屬水平的物種組成分析 進(jìn)一步從屬水平來(lái)看(圖6)，2組的優(yōu)勢(shì)菌屬一共有6種，分別是節(jié)細(xì)菌屬(Arthrobacter)、鞘氨醇單胞菌屬(Sphingomonas)、德沃斯氏菌屬(Devosia)、芽孢桿菌屬(Bacillus)、黃單胞菌屬(Xanthomonas)和溶桿菌屬(Lysobacter)。其中，節(jié)細(xì)菌屬在大田組(2.9%)的豐度明顯多于大棚組(0.9%)。而在大棚組中明顯增多的菌屬有芽孢桿菌屬、黃單胞菌屬和溶桿菌屬，它們?cè)诖笈锝M中的相對(duì)豐度分別是2.0%，1.1%，1.0%，在大田組中僅占1.0%，0.6%，0.3%。

圖6 屬水平物種組成Fig.6 Species composition in genera of pie

另外，土壤中還有一些豐度較低的菌屬，它們?cè)?組中也存在著明顯的差異。如表4所示，這些是2組間一部分差異較大的菌屬及其可能的功能。從表4可以看出，大棚組中病原菌與可以產(chǎn)生抗菌物質(zhì)的菌屬都很多，這可能是由于大棚環(huán)境封閉，以及長(zhǎng)期施肥用藥導(dǎo)致土壤中重金屬的積累，破壞了土壤微生物的平衡，容易富集一些病原微生物，同時(shí)相對(duì)應(yīng)的土壤中拮抗的微生物也會(huì)多。而大田組中固氮、降解纖維素和降解重金屬的微生物較多，這應(yīng)該是由于大田與外界環(huán)境交流頻繁，所以一些可以修復(fù)土壤和固氮的菌群相對(duì)豐度較大。

2.5 兩組間LEfse分析

基于分類信息的LEfse分析的進(jìn)化分支圖(圖7)可以更好地體現(xiàn)2組間存在的差異物種。從圖7可以看出，淺色部分是大棚土壤中的優(yōu)勢(shì)微生物，其中淺色區(qū)域較大的是厚壁菌門(mén)和擬桿菌門(mén)；深色部分是大田土壤中的優(yōu)勢(shì)微生物，其中放線菌門(mén)的區(qū)域較大。這與之前的分析保持一致。LEfse分析的進(jìn)化分支圖更可以形象地看出各個(gè)優(yōu)勢(shì)菌門(mén)中具體哪些菌群是優(yōu)勢(shì)菌群。

表4 大棚組與大田組土壤微生物差異菌屬比較分析Tab.4 Comparative analysis of soil microbial diversity in greenhouse and field groups

圖7 基于分類信息的LEfse分析的進(jìn)化分支Fig.7 Evolutionary branch graph of LEfse analysis based on classified information

2.6 Alpha多樣性分析

Alpha多樣性分析是通過(guò)對(duì)單樣品的多樣性分析反映微生物群落的豐度和多樣性。常用的有：Chao1值，即菌種的豐富度指數(shù)，用來(lái)估計(jì)群落中的OTU數(shù)目，數(shù)值越大說(shuō)明OTU數(shù)目越多；Shannon值，用來(lái)估算樣品中微生物多樣性的指數(shù)，同樣也是數(shù)值越大說(shuō)明群落多樣性越高[28]。

從圖8可以看出，大棚組的2個(gè)數(shù)值都要低一些，說(shuō)明大棚比大田的微生物多樣性要低一些。這應(yīng)該是大棚較為封閉的原因，長(zhǎng)期施肥用藥以及高濕高溫的環(huán)境，使得土壤中有害物質(zhì)和重金屬的積累破壞了土壤微生態(tài)的平衡，導(dǎo)致大棚土壤中微生物多樣性較差。而大田環(huán)境開(kāi)闊，與大環(huán)境交流頻繁，土壤中微生物多樣性較高，具有較好的修復(fù)能力。

圖8 Alpha多樣性指數(shù)boxFig.8 Alpha diversity index of box diagram

3 結(jié)論與討論

本試驗(yàn)利用Illumina Miseq 測(cè)序平臺(tái)對(duì)河北省中南部地區(qū)的大棚與大田土壤進(jìn)行高通量測(cè)序，測(cè)定了土壤中細(xì)菌16S rDNA的V3-V4可變區(qū)的序列，并對(duì)其進(jìn)行比對(duì)注釋和多樣性分析[29]。本次測(cè)序一共得到了495 124條優(yōu)質(zhì)序列，產(chǎn)生了5 821個(gè)OTU。通過(guò)對(duì)這些OTU進(jìn)行注釋，獲得了土壤樣品的多樣性信息，并對(duì)其進(jìn)行Alpha多樣性分析和β多樣性分析。通過(guò)Alpha多樣性分析表明，大田土壤中的微生物多樣性要多于大棚土壤，這可能是因?yàn)榇筇锫短扉_(kāi)闊的環(huán)境，使得大田土壤會(huì)隨著風(fēng)雨的變化與更多地區(qū)土壤微生物進(jìn)行交流。而大棚相對(duì)封閉，與外界交流的范圍和頻率要少很多，且長(zhǎng)期的高溫高濕環(huán)境以及長(zhǎng)期的施肥用藥，導(dǎo)致土壤中有害物質(zhì)和重金屬積累，所以大田土壤比大棚土壤的細(xì)菌多樣性要多。根據(jù)相關(guān)報(bào)道，土壤中微生物的多樣性越多，土壤的自我修復(fù)能力以及抗病的能力就會(huì)越強(qiáng)。

通過(guò)物種組成圖可以更進(jìn)一步地了解大棚與大田土壤中哪些微生物有著明顯的差異。從門(mén)水平來(lái)看，2組的優(yōu)勢(shì)菌群均為變形菌門(mén)、酸桿菌門(mén)、放線菌門(mén)和厚壁菌門(mén)等7個(gè)門(mén)類。其中，變形菌門(mén)所占比例最大，約占40%左右[30]。而放線菌門(mén)與厚壁菌門(mén)在2組中所占的比例就有所不同，差異最大的是放線菌門(mén)，在大棚中的豐度為14.4%，而在大田中為21.4%。因?yàn)樵S多放線菌會(huì)產(chǎn)生抗生素，所以這可能也是大田比大棚抗病性更強(qiáng)的原因。從綱水平的物種組成圖可以看出，2組土壤樣品的優(yōu)勢(shì)菌群基本相似，一共有15種優(yōu)勢(shì)菌群。同樣屬于變形菌門(mén)的幾個(gè)綱所占比例較大。從屬水平來(lái)看，2組的優(yōu)勢(shì)菌群一共有6種，節(jié)細(xì)菌屬(Arthrobacter)、鞘氨醇單胞菌屬(Sphingomonas)、德沃斯氏菌屬(Devosia)、芽孢桿菌屬(Bacillus)、黃單胞菌屬(Xanthomonas)和溶桿菌屬(Lysobacter)。其中，節(jié)細(xì)菌屬在2組中差異較大，大田中要比大棚中多很多。節(jié)細(xì)菌屬在土壤中具有固氮和降解重金屬的作用。這可能是大田土壤在固氮能力和修復(fù)能力方面要比大棚土壤強(qiáng)的一個(gè)原因。一些相對(duì)豐度低的菌屬中，大田土壤比大棚土壤相對(duì)豐度較多的也是一些具有固氮作用和降解纖維素作用的菌屬。這也驗(yàn)證了，大田在固氮能力和自我修復(fù)的能力上比大棚土壤要強(qiáng)。

綜上所述，通過(guò)對(duì)河北南部地區(qū)的大棚土壤與大田土壤進(jìn)行高通量測(cè)序，初步了解了2組樣品中細(xì)菌的組成情況。2組土壤中優(yōu)勢(shì)菌群種類基本相似，但有些菌群的相對(duì)豐度差異較大。從門(mén)和綱的水平來(lái)看，大田中的放線菌的相對(duì)豐度都是高于大棚土壤，而大棚中的厚壁菌門(mén)要多一些。從屬水平優(yōu)勢(shì)菌屬看，具有固氮和降解重金屬的節(jié)細(xì)菌屬在大田中的相對(duì)豐度要高于大棚。這可能是由大棚相對(duì)封閉的高溫高濕環(huán)境以及長(zhǎng)期施肥用藥引起的重金屬積累所導(dǎo)致的。這就使得大田的細(xì)菌多樣性高于大棚，而且大田土壤中在抗菌方面、固氮方面與修復(fù)方面的菌群也要多于大棚土壤。土壤中的微生物彼此之間存在著千絲萬(wàn)縷的聯(lián)系[31]，或許以后可以通過(guò)移植土壤來(lái)改善大棚中的種植環(huán)境，提高產(chǎn)量和抗病能力。