HPLC法同時(shí)測(cè)定蒙藥復(fù)方協(xié)日嘎—4中5種有效成分的含量

白鳳 董玉 李斌鑫 趙海龍

摘 要 目的：建立同時(shí)測(cè)定蒙藥復(fù)方協(xié)日嘎-4中高良姜素、高良姜素-3-甲醚、雙去甲氧基姜黃素、去甲氧基姜黃素、姜黃素含量的方法。方法：采用高效液相色譜法。色譜柱為Elite C18，流動(dòng)相為0.5%磷酸-乙腈（梯度洗脫），流速為0.6 mL/min，檢測(cè)波長(zhǎng)為235 nm（高良姜素、高良姜素-3-甲醚）、420 nm（雙去甲氧基姜黃素、去甲氧基姜黃素、姜黃素），柱溫為25 ℃，進(jìn)樣量為10 μL。結(jié)果：高良姜素、高良姜素-3-甲醚、雙去甲氧基姜黃素、去甲氧基姜黃素、姜黃素檢測(cè)進(jìn)樣量線性范圍分別為0.047 2～0.472 0 μg（r=0.999 9）、0.104 0～1.040 0 μg（r=0.999 9）、0.030 4～0.304 0 μg（r=0.999 9）、0.039 2～0.392 0 μg（r=0.999 8）、0.232 0～2.320 0 μg（r=0.999 7）；定量限分別為11.41、12.73、4.92、5.29、5.39 ng，檢測(cè)限分別為3.41、3.72、1.46、1.59、1.62 ng；精密度、穩(wěn)定性、重復(fù)性試驗(yàn)的RSD均小于3%；加樣回收率分別為97.24%～102.93%（RSD=2.01%，n=6）、95.10%～101.50%（RSD=2.34%，n=6）、95.23%～97.61%（RSD=0.97%，n=6）、97.10%～100.65%（RSD=1.24%，n=6）、 98.69%～101.15%（RSD=0.99%，n=6）。結(jié)論：該方法簡(jiǎn)單、準(zhǔn)確、重復(fù)性好，可用于蒙藥復(fù)方協(xié)日嘎-4中高良姜素、高良姜素-3-甲醚、雙去甲氧基姜黃素、去甲氧基姜黃素、姜黃素含量的同時(shí)測(cè)定。

關(guān)鍵詞 蒙藥；復(fù)方協(xié)日嘎-4；高良姜素；高良姜素-3-甲醚；雙去甲氧基姜黃素；去甲氧基姜黃素；姜黃素；高效液相色譜法；含量測(cè)定

中圖分類號(hào) R284.1 文獻(xiàn)標(biāo)志碼 A 文章編號(hào) 1001-0408（2018）14-1964-04

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2018.14.21

ABSTRACT OBJECTIVE： To establish a method for the simultaneous determination of galangin， galangin-3-methyl ether， bisdemethoxycurcumin， demethoxycurcumin and curcumin in mongolian medicine Xieriga-4. METHODS： HPLC method was adopted. The determination was performed on Elite C18 column with mobile phase consisted of 0.5% phosphoric acid-acetonitrile （gradient elution） at the flow rate of 0.6 mL/min. The detection wavelengths were set at 235 nm （galangin， galangin-3-methyl ether） and 420 nm （bisdemethoxycurcumin， demethoxycurcumin and curcumin）. The column temperature was set at 25 ℃， and sample size was 10 μL. RESULTS： The linear range of galangin， galangin-3-methyl ether， bisdemethoxycurcumin， demethoxycurcumin and curcumin were 0.047 2-0.472 0 μg（r=0.999 9）， 0.104 0-1.040 0 μg（r=0.999 9）， 0.030 4-0.304 0 μg（r=0.999 9），0.039 2-0.392 0 μg（r=0.999 8）， 0.232 0-2.320 0 μg（r=0.999 7）， respectively. The limits of quantitation were 11.41， 12.73， 4.92， 5.29， 5.39 ng； the limits of detection were 3.41， 3.72， 1.46， 1.59， 1.62 ng， respectively， respectively. RSDs of precision， stability and repeatability tests were all lower than 3%. The recovery rates were 97.24%-102.93%（RSD=2.01%，n=6）， 95.10%-101.50%（RSD=2.34%，n=6）， 95.23%-97.61%（RSD=0.97%，n=6）， 97.10%-100.65%（RSD=1.24%，n=6）， 98.69%-101.15%（RSD=0.99%，n=6）， respectively. CONCLUSIONS： The method is simple， accurate and reproducible. It can be used for simultaneous determination of galangin， galangin-3-methyl ether， bisdemethoxycurcumin， demethoxycurcumin and curcumin in mongolian medicine Xieriga-4.

KEYWORDS Mongolian medicine； Xieriga-4； Galangin； Galangin-3-methyl ether； Bisdemethoxycurcumin； Demethoxycur- cumin； Curcumin； HPLC； Content determination

蒙藥復(fù)方協(xié)日嘎-4是蒙醫(yī)臨床治療泌尿系統(tǒng)感染的常用處方[1]，該處方收載于《中華人民共和國(guó)衛(wèi)生部藥品標(biāo)準(zhǔn)·蒙藥分冊(cè)》[2]中，由姜黃、黃柏、梔子、蒺藜等4味藥材按配伍原則以5 ∶ 3 ∶ 4 ∶ 5（質(zhì)量比）組成，具有利尿、清泄?jié)駸岬裙π?，主要用于小便閉止、尿頻、尿急、尿中帶血、膀胱刺痛等癥[1]。從該復(fù)方中分離得到的姜黃素、去甲氧基姜黃素、雙去甲氧基姜黃素等姜黃素類成分已被證實(shí)是姜黃中具有抗炎、抗氧化、抗腫瘤等藥理作用的主要有效成分[3-8]；高良姜素、高良姜素-3-甲醚是從該復(fù)方姜黃藥材中首次分離得到的化合物，已有研究表明高良姜素具有廣泛的生物活性，如抗炎、抗菌和抗過(guò)敏等[9]。

本課題組前期對(duì)復(fù)方協(xié)日嘎-4的化學(xué)成分、質(zhì)量控制進(jìn)行了初步研究[10-13]。在此基礎(chǔ)上，本研究采用高效液相色譜法（HPLC）建立了同時(shí)測(cè)定該復(fù)方中高良姜素、高良姜素-3-甲醚、雙去甲氧基姜黃素、去甲氧基姜黃素、姜黃素5種成分含量的方法，旨在為完善其質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提供參考。

1 材料

1.1 儀器

Agilent 1100型HPLC儀，包括化學(xué)工作站、二元泵、內(nèi)置真空脫氣機(jī)、柱溫箱、輸液泵、手動(dòng)進(jìn)樣器、紫外檢測(cè)器（美國(guó)Agilent公司）；AB135-S型電子分析天平（美國(guó)Mettler-Toledo公司）。

1.2 藥品與試劑

復(fù)方協(xié)日嘎-4（內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院自制，編號(hào)：S1-S15）；高良姜素-3-甲醚對(duì)照品（上海穎心實(shí)驗(yàn)室設(shè)備有限公司，批號(hào)：20170919001，純度：99.8%）；高良姜素對(duì)照品（批號(hào)：111699-200501，純度：98.5%）、雙去甲氧基姜黃素對(duì)照品（批號(hào)：112004-201501，純度：95.0%）、去甲氧基姜黃素對(duì)照品（批號(hào)：112003-201501，純度：98.5%）均由中國(guó)食品藥品檢定研究院提供；姜黃素對(duì)照品（北京壇墨質(zhì)檢科技有限公司，批號(hào)：MUST-17050310，純度：98.9%）；乙腈為色譜純，其余試劑均為分析純，水為純化水。

1.3 藥材

蒙藥復(fù)方協(xié)日嘎-4制備所用各味藥材均經(jīng)內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院李驍副教授鑒定為真品，藥材樣品來(lái)源見表1。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件與系統(tǒng)適用性

色譜柱：Elite C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相：0.5%磷酸（A）-乙腈（B），梯度洗脫（0～10 min，36%→37% A；10～40 min，37%→38% A；40～50 min，38%→41% A；50～60 min，41% A）；流速：0.6 mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)：235 nm（高良姜素、高良姜素-3-甲醚）、420 nm（雙去甲氧基姜黃素、去甲氧基姜黃素、姜黃素）；柱溫：25 ℃；進(jìn)樣量：10 μL。在該色譜條件下，高良姜素、高良姜素-3-甲醚、雙去甲氧基姜黃素、去甲氧基姜黃素、姜黃素峰形尖銳、對(duì)稱性好；供試品中上述5種成分色譜峰與相鄰峰的分離度均大于1.5，均達(dá)到基線分離，理論板數(shù)以高良姜素峰計(jì)應(yīng)不低于14 000，陰性對(duì)照對(duì)測(cè)定無(wú)干擾。色譜圖見圖1。

2.2 溶液的制備

2.2.1 混合對(duì)照品溶液 精密稱取高良姜素對(duì)照品1.18 mg、高良姜素-3-甲醚對(duì)照品1.30 mg、雙去甲氧基姜黃素0.76 mg、去甲氧基姜黃素0.98 mg，分別置于5 mL量瓶中，加甲醇定容，得單一對(duì)照品貯備液。精密稱取姜黃素對(duì)照品0.58 mg，精密吸取上述高良姜素對(duì)照品貯備液0.5 mL、高良姜素-3-甲醚對(duì)照品貯備液1 mL、雙去甲氧基姜黃素對(duì)照品貯備液0.5 mL、去甲氧基姜黃素對(duì)照品貯備液0.5 mL，置于同一5 mL量瓶中，加甲醇定容，得高良姜素、高良姜素-3-甲醚、雙去甲氧基姜黃素、去甲氧基姜黃素、姜黃素質(zhì)量濃度分別為0.023 6、0.052 0、0.015 2、0.019 6、0.116 0 mg/mL的混合對(duì)照品溶液。

2.2.2 供試品溶液 精密稱取復(fù)方協(xié)日嘎-4樣品約10 g，置于500 mL圓底燒瓶中，加入10倍量70%乙醇加熱回流提取2次，每次2 h，合并濾液，減壓濃縮，置于25 mL量瓶中，加甲醇定容。將上述濃縮后的復(fù)方協(xié)日嘎-4樣品提取液加入大孔吸附樹脂柱經(jīng)水洗脫，棄去洗脫液，加入95%乙醇洗脫，回收溶劑并濃縮洗脫液，置于5 mL量瓶中，加甲醇定容，經(jīng)0.45 μm 微孔濾膜濾過(guò)，取續(xù)濾液，即得。

2.2.3 陰性對(duì)照溶液 按復(fù)方協(xié)日嘎-4處方，制備缺姜黃藥材的陰性樣品（精密稱取黃柏約1.6 g、梔子約2.4 g、蒺藜約3.0 g，依法操作），按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備陰性對(duì)照溶液。

2.3 線性關(guān)系考察

分別吸取“2.2.1”項(xiàng)下混合對(duì)照品溶液2、4、6、8、10、20 μL，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積。以各待測(cè)成分檢測(cè)進(jìn)樣量（x，μg）為橫坐標(biāo)、峰面積（y）為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，回歸方程與線性范圍見表 2。

2.4 定量限與檢測(cè)限考察

取“2.2.1”項(xiàng)下混合對(duì)照品溶液適量，倍比稀釋，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積。當(dāng)信噪比為10 ∶ 1時(shí)，得定量限；當(dāng)信噪比為3 ∶ 1時(shí)，得檢測(cè)限。結(jié)果，高良姜素、高良姜素-3-甲醚、雙去甲氧基姜黃素、去甲氧基姜黃素、姜黃素的定量限分別為11.41、12.73、4.92、5.29、5.39 ng，檢測(cè)限分別為3.41、3.72、1.46、1.59、1.62 ng。

2.5 精密度試驗(yàn)

取“2.2.2”項(xiàng)下同一供試品溶液（編號(hào)：S1）適量，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣測(cè)定6次，記錄峰面積。結(jié)果，高良姜素、高良姜素-3-甲醚、雙去甲氧基姜黃素、去甲氧基姜黃素、姜黃素峰面積的RSD分別為0.73%、0.22%、0.38%、0.67%、1.06%（n=6），表明本方法精密度良好。

2.6 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取“2.2.2”項(xiàng)下同一供試品溶液（編號(hào)：S1）6份，分別于室溫下放置0、2、4、8、10、12 h時(shí)按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積。結(jié)果，高良姜素、高良姜素-3-甲醚、雙去甲氧基姜黃素、去甲氧基姜黃素、姜黃素峰面積的RSD分別為1.54%、0.51%、0.50%、1.12%、0.74%（n=6），表明供試品溶液室溫放置12 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.7 重復(fù)性試驗(yàn)

精密稱取復(fù)方協(xié)日嘎-4樣品（編號(hào)：S1）約10 g，共6份，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，再按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積并計(jì)算樣品含量。結(jié)果，高良姜素、高良姜素-3-甲醚、雙去甲氧基姜黃素、去甲氧基姜黃素、姜黃素的平均含量分別為0.001 2%、0.002 1%、0.002 9%、0.001 4%、0.005 9%，RSD分別為2.92%、2.89%、2.61%、2.25%、2.23%（n=6），表明本方法重復(fù)性良好。

2.8 加樣回收率試驗(yàn)

精密稱取復(fù)方協(xié)日嘎-4樣品（編號(hào)：S1）5 g，共6份，分別加入一定量的5種成分對(duì)照品溶液，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，再按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積并計(jì)算加樣回收率，結(jié)果見表3。

2.9 樣品含量測(cè)定

分別取15批復(fù)方協(xié)日嘎-4樣品各適量，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，再按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，平行測(cè)定3次，記錄峰面積并按回歸方程計(jì)算樣品含量，結(jié)果見表4。

3 討論

3.1 測(cè)定成分的選擇

本課題組通過(guò)網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究[14]，篩選出復(fù)方協(xié)日嘎-4中所含的部分有效成分，并將其與前期分離得到的化學(xué)成分進(jìn)行對(duì)比分析，最終確定以高良姜素、高良姜素-3-甲醚、雙去甲氧基姜黃素、去甲氧基姜黃素、姜黃素為測(cè)定成分，以完善其質(zhì)量控制。

3.2 檢測(cè)波長(zhǎng)的選擇

本試驗(yàn)在200～400 nm 波長(zhǎng)范圍內(nèi)進(jìn)行全波長(zhǎng)掃描，結(jié)果發(fā)現(xiàn)高良姜素和高良姜素-3-甲醚在254 nm波長(zhǎng)附近吸收較好。本試驗(yàn)又分別比較了235、254、280 nm波長(zhǎng)的檢測(cè)結(jié)果，進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)檢測(cè)波長(zhǎng)為235 nm時(shí)高良姜素和高良姜素-3-甲醚的分離度較好，故選擇235 nm為高良姜素、高良姜素-3-甲醚的檢測(cè)波長(zhǎng)。2015年版《中國(guó)藥典》（一部）中姜黃素的檢測(cè)波長(zhǎng)為430 nm[15]，筆者結(jié)合本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)雙去甲氧基姜黃素、去甲氧基姜黃素、姜黃素在420 nm波長(zhǎng)處分離較好，且干擾少，故選擇420 nm為這3種成分的檢測(cè)波長(zhǎng)。

3.3 流動(dòng)相的選擇

本試驗(yàn)考察了0.5%乙酸-甲醇、0.5%磷酸-甲醇、0.5%乙酸-乙腈、0.5%磷酸-乙腈和0.2%磷酸-乙腈5種不同組成及比例的流動(dòng)相。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，高良姜素、高良姜素-3-甲醚、雙去甲氧基姜黃素、去甲氧基姜黃素、姜黃素采用含甲醇的流動(dòng)相時(shí)分離度較差，而采用含乙腈的流動(dòng)相時(shí)分離度較好，故選擇含乙腈的流動(dòng)相[16]。又通過(guò)比較發(fā)現(xiàn)，流動(dòng)相中加入磷酸分離度較好，且磷酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)越高分離度越好[17]，故最終選擇0.5%磷酸-乙腈（梯度洗脫）為流動(dòng)相。在此條件下，高良姜素、高良姜素-3-甲醚、雙去甲氧基姜黃素、去甲氧基姜黃素、姜黃素均能達(dá)到基線分離，且峰形較好。

3.4 流速的選擇

流速是色譜條件中的重要因素，流速增加可使樣品分析時(shí)間縮短，但流速過(guò)快又會(huì)使樣品組分的分離效果變差。本試驗(yàn)分別考察了0.4、0.6、0.8、1.0 mL/min 4個(gè)流速，結(jié)果發(fā)現(xiàn)流速為0.6 mL/min時(shí)，高良姜素、高良姜素-3-甲醚、雙去甲氧基姜黃素、去甲氧基姜黃素、姜黃素的分離度均較好且分析時(shí)間較短，故最終選擇0.6 mL/min為流速。

綜上所述，本方法簡(jiǎn)單、準(zhǔn)確、重復(fù)性好，可用于同時(shí)測(cè)定蒙藥復(fù)方協(xié)日嘎-4中高良姜素、高良姜素-3-甲醚、雙去甲氧基姜黃素、去甲氧基姜黃素、姜黃素5種成分的含量。

參考文獻(xiàn)

[ 1 ] 內(nèi)蒙古衛(wèi)生廳. 內(nèi)蒙古蒙成藥標(biāo)準(zhǔn)[M].赤峰：內(nèi)蒙古科技人民出版社，1984：265.

[ 2 ] 國(guó)家藥典委員會(huì). 中華人民共和國(guó)衛(wèi)生部藥品標(biāo)準(zhǔn)：蒙藥分冊(cè)[S]. 1998：87.

[ 3 ] 國(guó)家醫(yī)藥管理局中草藥情報(bào)中心站. 植物藥有效成分手冊(cè)[M].北京：人民衛(wèi)生出版社，1984： 281-282.

[ 4 ] 李偉鋒，蔣建蘭. 姜黃素藥理作用的研究現(xiàn)狀[J].中國(guó)臨床藥理學(xué)雜志，2017，33（10）：957-960.

[ 5 ] 胡文卓，李杜，馮瑪莉. 姜黃素藥理作用的研究進(jìn)展[J].世界最新醫(yī)學(xué)信息文摘，2017，17（40）：31-33、43.

[ 6 ] 王敏，馮彩霞，郭立杰，等. 姜黃素應(yīng)用于肝臟疾病的研究進(jìn)展[J].解放軍醫(yī)藥雜志，2016，28（5）：113-116.

[ 7 ] 張英，李冬梅，邢穎. 姜黃素的藥理作用與載體研究進(jìn)展[J].中國(guó)藥房，2015，26（13）：1850-1853.

[ 8 ] 章村田. 姜黃藥理作用研究進(jìn)展[J].河南中醫(yī)，2015，35（5）：1188-1190.

[ 9 ] 張旭光，尹航，陳峰，等. 高良姜素藥理活性的研究進(jìn)展[J]. 中國(guó)現(xiàn)代中藥，2016，18（11）：1532-1536.

[10] 高建華，楊婷，董玉. 蒙藥復(fù)方協(xié)日嘎四味湯散的化學(xué)成分研究[J].中國(guó)藥房，2014，25（47）：4470-4472.

[11] 高建華，李斌鑫，白鳳，等. 蒙藥復(fù)方協(xié)日嘎四味化學(xué)成分的研究[J].北京中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào)，2016，39（9）：755-758.

[12] 李斌鑫，高建華，董玉，等. 蒙藥協(xié)日嘎-4不同配伍對(duì)總萜和梔子苷含量的影響[J].內(nèi)蒙古大學(xué)學(xué)報(bào)（自然科學(xué)版），2017，48（2）：164-168.

[13] 冀云濤，朱小玲，李斌鑫，等. RP-HPLC法同時(shí)測(cè)定蒙藥復(fù)方協(xié)日嘎-4中梔子苷、京尼平-1-O-β-D-龍膽二糖苷、西紅花苷-1、西紅花苷-3的含量[J].內(nèi)蒙古大學(xué)學(xué)報(bào)（自然科學(xué)版），2016，47（6）：604-608.

[14] 白鳳，李斌鑫，董玉，等. 蒙藥復(fù)方協(xié)日嘎-4的網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究[J].北京中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào)，2018，41（2）：140-147.

[15] 國(guó)家藥典委員會(huì). 中華人民共和國(guó)藥典：一部[S].2015年版.北京：中國(guó)醫(yī)藥科技出版社，2015：264.

[16] 全紅娜，金松子，雷勇勝，等. 反相高效液相色譜中流動(dòng)相選擇與優(yōu)化的研究進(jìn)展[J].現(xiàn)代藥物與臨床，2014，29（10）：1190-1194.

[17] 王麗，申蘭慧，陳國(guó)清. 淺談樣品溶劑對(duì)高效液相色譜行為的影響[J].中國(guó)藥事， 2013， 27（2）： 163-166.

（收稿日期：2018-02-23 修回日期：2018-05-17）

（編輯：陳 宏）