蛇葡萄素F對脂多糖致炎模型細胞的抗炎作用及其機制研究

梁曉玲 馬利 賴月花 侯連兵

摘 要 目的：研究蛇葡萄素F（AMPF）對脂多糖（LPS）致炎模型細胞的抗炎作用及其機制。方法：以RAW264.7細胞為模型細胞，采用CCK-8法測定不同質(zhì)量濃度（100、40、20、10、5 μg/mL）的AMPF處理不同時間（24、48、72 h）后的細胞活性。設(shè)正常對照組、模型組和AMPF高、中、低劑量組（40、20、10 μg/mL），分別未加藥物處理或加入相應(yīng)質(zhì)量濃度的AMPF溶液處理后培養(yǎng)24 h[除正常對照組外，其余各組均在培養(yǎng)1 h時加入LPS（1 μg/mL）致炎造模]。測定各組細胞中白細胞介素1β（IL-1β）、IL-6、腫瘤壞死因子α（TNF-α）和一氧化氮（NO）的含量，以及環(huán)氧合酶2（COX-2）和一氧化氮合酶（iNOS）的蛋白表達水平。結(jié)果：當(dāng)培養(yǎng)時間為24 h時，AMPF各質(zhì)量濃度組（100、40、20、10、5 μg/mL）細胞存活率均高于90%，AMPF未對細胞產(chǎn)生明顯毒性。與模型組比較，AMPF高、中、低劑量組細胞中IL-1β的含量和iNOS的蛋白表達水平均顯著降低，高劑量組細胞中IL-6、TNF-α、NO的含量均顯著降低，高、中劑量組細胞中COX-2的蛋白表達水平均顯著降低，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05或P<0.01），并呈現(xiàn)一定的劑量依賴性。結(jié)論：AMPF對LPS誘導(dǎo)的RAW264.7細胞炎癥具有顯著的抑制作用，其機制可能與AMPF調(diào)控COX-2和iNOS的表達，進而抑制NO的釋放，降低IL-1β、IL-6和TNF-α的含量有關(guān)。

關(guān)鍵詞 蛇葡萄素F；RAW264.7細胞；脂多糖；炎癥；炎癥因子

中圖分類號 R285 文獻標志碼 A 文章編號 1001-0408（2018）14-1927-04

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2018.14.13

ABSTRACT OBJECTIVE： To study the anti-inflammatory effect of ampelopsin F （AMPF） on lipopolysaccharide （LPS）-induced inflammatory model cells and its mechanism. METHODS： Using RAW264.7 cell as model cell， CCK-8 assay was used to determine the activity of cell after treated for different duration （24， 48， 72 h） with different concentration （100， 40， 20， 10， 5 μg/mL） of AMPF. Then the cells were divided into control group， model group and AMPF high-dose， medium-dose and low-dose groups （40， 20， 10 μg/mL）. They were cultured without or with relevant AMPF solution for 24 h [Except for normal control group， other groups received LPS （1 μg/mL） to induce inflammatory model after cultured for 1 h]. The contents of IL-1β， IL-6， TNF-α and NO， the protein expression of COX-2 and iNOS were detected in cell culture supernatant. RESULTS： After cultured for 24 h， survival rates of cells in AMPF groups （100， 40， 20， 10， 5 μg/mL） were all higher than 90%， showing no obvious cytotoxicity of AMPF. Compared with model group， the content of IL-1β and the protein expression of iNOS were decreased significantly in AMPF high-dose， medium-dose and low-dose groups； the contents of IL-6， TNF-α and NO were decreased significantly in AMPF high-dose group； the protein expression of COX-2 were decreased significantly in AMPF high-dose and medium-dose groups， with statistical significance （P<0.05 or P<0.01）， in dose-dependent manner. CONCLUSIONS： AMPF shows significant anti-inflammatory effect on LPS-induced RAW264.7 cell inflammation， the mechanism of which may be associated with regulating the expression of COX-2 and iNOS， inhibiting the release of NO and decreasing the contents of IL-1β， IL-6， TNF-α and NO.

KEYWORDS Ampelopsin F； RAW264.7 cells； Lipopolysaccharide； Inflammation； Inflammatory factor

金剛藤又名菝葜，為百合科植物菝葜（Smilax china L.）的根莖，具有祛風(fēng)、活血、解表、收斂止血等功效[1]；其相關(guān)制劑用于慢性盆腔炎的臨床治療效果也得到了證實[2]。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，金剛藤總黃酮提取物對慢性盆腔炎模型大鼠具有良好的藥效[3-4]。Jin Q等[5]從金剛藤總黃酮提取物中分離出多個單體成分，蛇葡萄素F（Ampelopsin F，AMPF）作為其中具有抗慢性盆腔炎作用的單體化合物之一，已被證實具有抗氧化活性。但關(guān)于AMPF的藥理藥效學(xué)等方面的研究報道甚少。小鼠腹腔巨噬細胞系RAW264.7具有免疫調(diào)節(jié)作用，常作為免疫相關(guān)研究的模型細胞系[6]。為探索金剛藤的抗炎藥效物質(zhì)基礎(chǔ)，本課題組根據(jù)文獻[7]方法以RAW264.7細胞構(gòu)建脂多糖（LPS）誘導(dǎo)的巨噬細胞炎癥模型，考察AMPF的抗炎作用，并通過細胞中炎癥蛋白環(huán)氧合酶2（COX-2）和一氧化氮合酶（iNOS）的表達變化探索AMPF的抗炎作用機制，以期深入開發(fā)傳統(tǒng)中藥材中的有效抗炎單體。

1 材料

1.1 儀器

Tanon-5200型電化學(xué)分析儀（上海天能科技有限公司）；PowerPac系列Bio-Rad電泳儀（美國伯樂公司）；SpectraMax M5型多功能酶標儀（美國 MDS公司）；1285型CO2細胞培養(yǎng)箱（美國Thermo Electron公司）。

1.2 藥品與試劑

AMPF標準品（武漢天植生物技術(shù)有限公司，批號：CFS201701，純度：98%）；CCK-8細胞增殖毒性檢測試劑盒（美國Bimake公司）；LPS（美國Sigma公司）；胎牛血清（FBS）、胰酶、DMEM高糖培養(yǎng)基（美國Gibco公司）；白細胞介素1β（IL-1β，批號：CSB-E08054m）、IL-6（批號：CSB-E04639m）、腫瘤壞死因子α（TNF-α，批號：CSB- E08054m）、酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）檢測試劑盒均購自武漢華美生物工程有限公司；總蛋白提取試劑盒（江蘇凱基生物技術(shù)股份有限公司，批號：20170112）；一氧化氮（NO）檢測試劑盒（上海碧云天生物技術(shù)有限公司，批號：20170211）；其余試劑均為市售分析純，水為雙蒸水。

1.3 細胞

小鼠腹腔巨噬細胞系RAW264.7購自中國科學(xué)院細胞庫。

2 方法

2.1 細胞培養(yǎng)

RAW264.7細胞采用含10%FBS的DMEM高糖培養(yǎng)基，于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，細胞隔天進行一次傳代。待細胞生長至對數(shù)生長期后，經(jīng)胰酶消化后，加入含10%FBS的DMEM高糖培養(yǎng)基吹打均勻，配制成細胞懸液，調(diào)整細胞密度為1×105個/mL，待用。

2.2 AMPF溶液配制

取AMPF標準品5 mg，以500 μL甲醇溶解制成10 mg/mL的母液；取AMPF標準品母液適量，用含10%FBS的DMEM高糖培養(yǎng)基稀釋，制成終質(zhì)量濃度分別為100、40、20、10、5 μg/mL的AMPF溶液，用于后續(xù)試驗。

2.3 AMPF對細胞活性的影響考察

取“2.1”項下RAW264.7細胞懸液接種于96孔板，每孔100 μL，設(shè)AMPF不同質(zhì)量濃度組[AMPF終質(zhì)量濃度分別為100、40、20、10、5、0（空白）μg/mL]，每個質(zhì)量濃度組設(shè)3個復(fù)孔，分別加入相應(yīng)質(zhì)量濃度的AMPF溶液，于37 ℃、5%CO2條件下分別培養(yǎng)24、48、72 h。棄去上清液，每孔加入CCK-8試劑10 μL、含10%FBS的DMEM高糖培養(yǎng)基90 μL，避光繼續(xù)培養(yǎng)1 h。采用酶標儀，在450 nm波長處測定各孔的吸光度（OD），計算細胞存活率[細胞存活率（%）=（OD樣品-OD空白）/OD空白×100%]。

2.4 AMPF對LPS致炎細胞中IL-1β、IL-6和TNF-α含量的影響考察

采用ELISA法測定IL-1β、IL-6和TNF-α含量。取“2.1”項下RAW264.7細胞懸液接種于6孔板，每孔2 mL，設(shè)正常對照組、模型組和AMPF高、中、低劑量組（AMPF終質(zhì)量濃度分別為40、20、10 μg/mL），正常對照組與模型組未加入藥物處理，在37 ℃、5%CO2條件下培養(yǎng)24 h[除正常對照組外，其余各組均在培養(yǎng)1 h時加入LPS溶液（LPS終質(zhì)量濃度為1 μg/mL）以誘導(dǎo)細胞炎癥]。取各組細胞上清液，采用IL-1β、IL-6和TNF-α檢測試劑盒，按照說明書步驟操作進行含量測定。

2.5 AMPF對LPS致炎細胞中COX-2和iNOS蛋白表達水平的影響考察

采用Western blot法測定COX-2和iNOS蛋白表達水平。按“2.4”項下方法進行細胞接種、分組、給藥、造模、培養(yǎng)。取各組細胞上清液，提取COX-2和iNOS總蛋白，具體操作均按照總蛋白提取試劑盒說明書步驟進行。所得蛋白置于100 ℃水浴5～10 min滅活后，采用十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠（SDS-PAGE）電泳，轉(zhuǎn)膜，電化學(xué)分析儀拍照。通過Image J 1.8.0軟件分析蛋白電泳條帶的灰度值并與內(nèi)參（GADPH）灰度值比較，計算得相對灰度值用以表示相關(guān)蛋白表達水平。

2.6 AMPF對LPS致炎細胞中NO含量的影響考察

按“2.4”項下方法進行細胞接種、分組、給藥、造模、培養(yǎng)。取各組細胞上清液，采用NO檢測試劑盒，按照說明書步驟操作進行含量測定。

2.7 統(tǒng)計學(xué)方法

采用GraphPad Prism 5.01軟件處理試驗數(shù)據(jù)。計量資料以平均值表示，采用單因素方差分析進行組間比較。P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 各組細胞存活率測定結(jié)果

細胞活性考察結(jié)果顯示，當(dāng)培養(yǎng)時間為24 h時，AMPF各質(zhì)量濃度組（100、40、20、10、5 μg/mL）細胞存活率均高于90%，表明細胞活性較好。本課題組選擇中間3個質(zhì)量濃度梯度（40、20、10 μg/mL）進行后續(xù)試驗。

3.2 各組細胞中IL-1β、IL-6和TNF-α的含量測定結(jié)果

與正常對照組比較，模型組細胞中IL-1β、IL-6和TNF-α的含量均顯著升高，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01）。與模型組比較，AMPF高、中、低劑量組細胞中IL-1β的含量均顯著降低，AMPF高劑量組細胞中IL-6、TNF-α的含量均顯著降低，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05或P<0.01）。各組細胞中IL-1β、IL-6和TNF-α的含量比較見圖1。

3.3 各組細胞中COX-2和iNOS的蛋白表達水平測定結(jié)果

與正常對照組比較，模型組細胞中COX-2和iNOS的蛋白表達水平均顯著升高，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05或P<0.01）。與模型組比較，AMPF高、中劑量組細胞中COX-2的蛋白表達水平均顯著降低，AMPF高、中、低劑量組細胞中iNOS的蛋白表達水平均顯著降低，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。各組細胞中COX-2和iNOS的蛋白表達電泳圖見圖2，蛋白表達水平比較見圖3。

3.4 各組細胞中NO的含量測定結(jié)果

與正常對照組比較，模型組細胞中NO的含量顯著升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01）。與模型組比較，AMPF高劑量組細胞中NO的含量顯著降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。各組細胞中NO的含量比較見圖4。

4 討論

炎癥是一種伴隨多種疾病狀態(tài)的病理現(xiàn)象，巨噬細胞是機體主要的炎癥細胞之一。有研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)巨噬細胞受到外界抗原（如LPS）刺激時，會釋放NO、IL-1β和TNF-α等炎癥因子，它們可促進炎癥反應(yīng)和組織損傷[8-9]。RAW264.7細胞屬于小鼠巨噬細胞系，常被應(yīng)用于炎癥反應(yīng)的研究。本試驗采用不同質(zhì)量濃度的AMPF（100、40、20、10、5 μg/mL）作用于RAW264.7細胞，以考察AMPF對細胞活性的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，上述不同質(zhì)量濃度的AMPF作用于細胞24 h后，細胞存活率均高于90%，表明細胞活性較好，AMPF未對細胞產(chǎn)生明顯毒性，因此選擇40、20、10 μg/mL 3個質(zhì)量濃度梯度的AMPF進行后續(xù)試驗。

IL-1β、IL-6和TNF-α是機體早期炎癥標志物，由單核-巨噬細胞系統(tǒng)和內(nèi)皮細胞分泌產(chǎn)生，其主要生物學(xué)特性是介導(dǎo)炎癥反應(yīng)[10-11]。本試驗采用ELISA法測定LPS致炎細胞經(jīng)AMPF（40、20、10 μg/mL）處理后培養(yǎng)上清液中炎癥因子IL-1β、IL-6和TNF-α的含量，結(jié)果顯示，AMPF能夠抑制細胞中IL-1β、IL-6和TNF-α的釋放，并呈現(xiàn)一定的劑量依賴性，其中40、20、10 μg/mL的 AMPF能顯著抑制IL-1β的釋放，40 μg/mL的AMPF能顯著抑制IL-6和TNF-α的釋放。

在生理狀態(tài)下，COX-2在絕大多數(shù)組織細胞中不表達，只有在細胞受到各種刺激（包括生長因子和細胞因子、血清、促癌劑、癌基因、NO等）時才誘導(dǎo)性表達[12-13]。NO作為炎癥發(fā)展過程中的促炎因子，參與多種生理和病理過程：在體內(nèi)，iNOS主要是在炎癥和免疫刺激下表達，進而催化L-精氨酸生成NO，過量的NO則會促進炎癥性疾病的發(fā)生和發(fā)展[14]。本試驗分別用不同質(zhì)量濃度的AMPF處理LPS致炎細胞，結(jié)果發(fā)現(xiàn)40 μg/mL的AMPF能顯著抑制細胞中NO的釋放。通過Western Blot法測定各組細胞中COX-2和iNOS的蛋白表達水平，結(jié)果顯示40、20 μg/mL的AMPF能顯著抑制細胞中COX-2的蛋白表達，40、20、10 μg/mL的AMPF能顯著抑制iNOS的蛋白表達。本研究結(jié)果顯示，當(dāng)細胞受到LPS刺激后，胞內(nèi)COX-2和iNOS的蛋白表達均顯著增強，表明炎癥通路被激活；而AMPF能夠抑制COX-2和iNOS的蛋白表達，這可能是其抗炎作用的機制之一。

此外有研究發(fā)現(xiàn)，LPS作用于Toll樣受體后，能激活核因子-κB（NF-κB）信號通路進而激活COX-2/前列腺素E2（PGE2）信號通路，使炎癥細胞釋放促炎因子和細胞毒性物質(zhì)，如IL-1β、IL-6、TNF-α、NO、PGE2等[15]。NF-κB是早期核轉(zhuǎn)錄因子，對參與免疫反應(yīng)各階段的許多分子都具有調(diào)控作用。在炎癥相關(guān)蛋白COX-2和iNOS的上游，是否存在與AMPF抗炎作用密切相關(guān)的關(guān)鍵靶點如NF-κB，仍有待進一步研究。

綜上所述，AMPF對LPS誘導(dǎo)的RAW264.7細胞炎癥具有顯著的抑制作用，其機制可能與AMPF能調(diào)控COX-2和iNOS的蛋白表達，進而抑制NO的釋放，降低IL-1β、IL-6和TNF-α的含量有關(guān)。但其明確的作用機制仍有待后續(xù)深入研究證實。

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（收稿日期：2017-11-14 修回日期：2018-05-22）

（編輯：段思怡）