水飛薊噴霧劑對(duì)大鼠深Ⅱ度燙傷創(chuàng)面修復(fù)的影響

衛(wèi)昊 劉清 張曉雙 劉繼平 許棟

〔摘要〕 目的 考察水飛薊噴霧劑對(duì)大鼠深Ⅱ度燙傷創(chuàng)面修復(fù)作用及機(jī)制。方法 建立深Ⅱ度燙傷模型大鼠，隨機(jī)分為模型組、美寶濕潤(rùn)燒傷膏組（24 g/kg）、水飛薊噴霧劑小劑量組（24 g/kg）、水飛薊噴霧劑中劑量組（48 g/kg）、水飛薊噴霧劑大劑量組（96 g/kg）和空白組，連續(xù)給藥21 d。分別在造模后第3、7、14、21天計(jì)算燙傷創(chuàng)面愈合率，檢測(cè)血清超氧化物歧化酶（superoxide dismutase， SOD）活性和丙二醛（malondialdehyde， MDA）含量;免疫組化法檢測(cè)燙傷創(chuàng)面堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子（basic fibroblast growth factor，b-FGF）、表皮生長(zhǎng)因子（epidermal growth factor， EGF） 、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β （transformating growth factor betal， TGF-β）的表達(dá)。結(jié)果 與模型組相比，燙傷后第3天，水飛薊噴霧劑小劑量組、中劑量組、大劑量組創(chuàng)面愈合率提高，血清SOD活性升高，MDA含量降低，且差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）;燙傷后第7、14天，水飛薊噴霧劑大劑量組血清SOD活性升高，MDA含量降低，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）;同時(shí)水飛薊噴霧劑各劑量組均可不同程度誘導(dǎo)受損組織內(nèi)bFGF、EGF、TGF-β的表達(dá)。結(jié)論 水飛薊噴霧劑對(duì)大鼠深Ⅱ度燙傷創(chuàng)面有修復(fù)作用，可促進(jìn)燙傷創(chuàng)面的愈合，其機(jī)制可能與抗氧化，增加b-FGF、EGF、TGF-β的表達(dá)有關(guān)。

〔關(guān)鍵詞〕 水飛薊噴霧劑;深Ⅱ°燙傷;創(chuàng)面;b-FGF;EGF;TGF-β

〔中圖分類號(hào)〕R283? ? ? ?〔文獻(xiàn)標(biāo)志碼〕A? ? ? ?〔文章編號(hào)〕doi：10.3969/j.issn.1674-070X.2018.12.006

水飛薊為菊科植物水飛薊Silybummarianum（L.）Gaertn.的干燥成熟果實(shí)，具有清熱解毒、疏肝利膽等功效，臨床上用于治療肝膽濕熱、脅痛，黃疸[1]。水飛薊及其復(fù)方的提取物對(duì)淺Ⅱ度燙傷具有較好的療效，可有效緩解疼痛，促進(jìn)組織修復(fù)[2-3]。本文在前期水飛薊膏劑對(duì)淺Ⅱ度燙傷模型研究基礎(chǔ)上，建立深Ⅱ度燙傷動(dòng)物模型，改變受試藥物劑型，研究水飛薊噴霧劑對(duì)燙傷大鼠創(chuàng)面愈合率、血清超氧化物歧化酶（superoxide dismutase， SOD）活性和丙二醛（malondialdehyde，MDA）含量、燙傷創(chuàng)面堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子（basic fibroblast growth factor， b-FGF）、表皮生長(zhǎng)因子（epidermal growth factor， EGF）、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β（transformating growth factor betal， TGF-β）表達(dá)的影響，探討水飛薊噴霧劑在促進(jìn)燙傷創(chuàng)面愈合中的作用及機(jī)制。

1 材料與方法

1.1? 藥品和試劑

水飛薊種子，陜西興盛德藥業(yè)有限責(zé)任公司，批號(hào)：20160401;美寶濕潤(rùn)燒傷膏，汕頭市美寶制藥有限公司，批號(hào)：1600604k;超氧化歧化酶（SOD）測(cè)定試劑盒，南京建成生物工程研究所;批號(hào)：20170324，丙二醛（MDA）測(cè)定試劑盒，批號(hào)：20170414，南京建成生物工程研究所;兔抗 b-FGF多克隆抗體（NO.10N36）、兔抗EGF多克隆抗體（NO.10N213）、兔抗TGF-β多克隆抗體（NO.10N51）、SABC試劑盒（07k21cj）、DAB試劑盒（07125c20），均由武漢博士德生物工程有限公司提供;水合氯醛，上海浦江化工有限公司，批號(hào)：20150308;硫化鈉，天津市天力化學(xué)試劑有限公司，批號(hào)：20161210;乳酸鈉林格注射液，安徽雙鶴藥業(yè)有限公司，批號(hào)：20170305。

1.2? 動(dòng)物

SD大鼠72只，SPF級(jí)，體質(zhì)量180～220 g，雌雄各半，購自成都達(dá)碩實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK（川）2015-030。

1.3? 儀器

CPA225D型精密分析天平，Sartorius公司;TDL-80-2B低速臺(tái)式離心機(jī)，上海安亭科學(xué)儀器廠;UV2100雙光束紫外可見分光光度計(jì)，北京瑞利分析儀器有限公司;ELX808IU酶標(biāo)儀，由BioTEK公司;超低溫保存箱，Haier公司;RM2235型手動(dòng)輪轉(zhuǎn)式切片機(jī)，Leica公司;Axio Imager M2型正置顯微鏡，Zeiss公司。

1.4? 方法

1.4.1? 水飛薊噴霧劑的制備? 取水飛薊藥材適量，分別用95%乙醇在煎藥機(jī)中提取2次，每次2 h，過濾，合并濾液，回收乙醇，濃縮至2 g（生藥）/mL，灌裝入噴壺，封口，即得。

1.4.2? 造模、分組和給藥? 造模前大鼠禁食12 h，用硫化鈉在大鼠背部脫毛，面積約 3 cm×3 cm，清水洗凈，擦干。除空白組外，其余各組以10%水合氯醛300 mg/kg腹腔注射麻醉大鼠，鐵板在沸水中煮15 min，然后緊貼于大鼠裸露皮膚15 s，燙傷后各組均以乳酸鈉林格注射液腹腔注射300 mL/kg抗休克治療。取創(chuàng)傷組織制作病理切片，光鏡下觀察表皮、真皮層及汗腺等附件組織損傷情況，證實(shí)造成大鼠深Ⅱ度燙傷模型。造模成功后，將造模成功的大鼠隨機(jī)分為分模型組，美寶濕潤(rùn)燒傷膏組（24 g/kg），水飛薊噴霧劑小劑量組（24 g/kg）、水飛薊噴霧劑中劑量組（48 g/kg）、水飛薊噴霧劑大劑量組（96 g/kg）和空白組，每組12只。美寶濕潤(rùn)燒傷膏組每天涂抹給藥1次，水飛薊各組每天噴藥2次，連續(xù)給藥21 d?？瞻捉M和模型組每天給予同體積的生理鹽水。

1.4.3? 指標(biāo)檢測(cè)? 分別在造模后第3、7、14、21天，對(duì)大鼠創(chuàng)面進(jìn)行平面拍照，計(jì)算創(chuàng)傷面積及創(chuàng)面愈合率。

創(chuàng)面愈合率=（原始燙傷面積-各時(shí)間點(diǎn)未愈合面積）/原始燙傷面積×100%

分別在在造模后第3、7、14、21天，每次取3只大鼠，10%水合氯醛麻醉后，腹主動(dòng)脈取血，3 000 r/min離心30 min，取上清液，檢測(cè)血清SOD活性和MDA含量;切取燙傷區(qū)域全層皮膚，面積約1 cm×1 cm，將皮膚組織放在10%甲醛溶液固定，免疫組化法檢測(cè)b-FGF、EGF、TGF-β的表達(dá)，免疫組化陽性結(jié)果為在光鏡下觀察到細(xì)胞漿中有棕黃色顆粒。

1.5? 統(tǒng)計(jì)方法

采用SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。所有數(shù)據(jù)“x±s”表示，數(shù)據(jù)處理采用單因素方差分析，組間比較采用Q檢驗(yàn)。以P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1? 水飛薊噴霧劑對(duì)燙傷大鼠創(chuàng)面愈合率的影響

燙傷后第3天，美寶濕潤(rùn)燒傷膏組、水飛薊噴霧劑小劑量組、中劑量組、大劑量組創(chuàng)面愈合率升高，與模型組相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）;燙傷后第14天，水飛薊噴霧劑小劑量組與模型組相比創(chuàng)面愈合率升高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）;燙傷后第7、21天，與模型組相比，其余各組創(chuàng)面愈合率無顯著變化，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），但第21天各組創(chuàng)面愈合率均達(dá)到92%以上。見表1。

2.2? 水飛薊噴霧劑對(duì)燙傷大鼠血清SOD活性的影響

與模型組相比，燙傷后第3天，美寶濕潤(rùn)燒傷膏組、水飛薊噴霧劑小劑量組、中劑量組、大劑量組血清SOD活性均上升，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）;燙傷后第7、14天，美寶濕潤(rùn)燒傷膏組、水飛薊噴霧劑大劑量組血清SOD活性均上升，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。見表2。

2.3? 水飛薊噴霧劑對(duì)燙傷大鼠血清MDA含量的影響

與模型組相比，燙傷后第3天，美寶濕潤(rùn)燒傷膏組、水飛薊噴霧劑小劑量組、中劑量組、大劑量組血清MDA含量均降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）;燙傷后第7、14天，美寶濕潤(rùn)燒傷膏組、水飛薊噴霧劑大劑量組血清MDA含量均降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。見表3。

2.4? 水飛薊噴霧劑對(duì)燙傷大鼠的皮膚創(chuàng)面b-FGF、EGF、TGF-β表達(dá)影響

與模型組比較，美寶濕潤(rùn)燒傷膏組和水飛薊噴霧劑大劑量組b-FGF、EGF、TGF-β陽性表達(dá)增加。見圖1-3。

3 討論

燒燙傷是人體最大最外部器官-皮膚極易遭受的創(chuàng)傷，是目前醫(yī)學(xué)研究的熱點(diǎn)。創(chuàng)傷修復(fù)是皮膚在損傷發(fā)生后多種修復(fù)細(xì)胞、生長(zhǎng)因子和細(xì)胞外基質(zhì)之間相互作用而進(jìn)行自我修復(fù)的復(fù)雜動(dòng)態(tài)過程。傷口接受外界刺激后最初經(jīng)歷氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)階段，隨后才是組織的修復(fù)和瘢痕階段[4-5]。燒燙傷會(huì)使創(chuàng)面處于一個(gè)暫時(shí)的缺氧狀態(tài)，因此機(jī)體內(nèi)氧自由基爆發(fā)性產(chǎn)生[6]。自由基的清除與抗氧化物的活性相關(guān)，SOD是機(jī)體內(nèi)唯一以氧自由基為底物的酶，具有高效的催化作用。SOD是體內(nèi)的一種重要的抗氧化保護(hù)酶，它的活力高低間接反應(yīng)了機(jī)體清除氧自由基的能力。MDA是自由基作用于脂質(zhì)發(fā)生過氧化反應(yīng)的終產(chǎn)物，會(huì)引起蛋白質(zhì)、核酸等生命大分子的交聯(lián)聚合，且具有細(xì)胞毒性，因而MDA的含量高低又間接反應(yīng)了機(jī)體細(xì)胞被自由基侵襲的嚴(yán)重程度。

生長(zhǎng)因子是一類對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)與分化有顯著作用的多肽，對(duì)創(chuàng)面愈合作用呈現(xiàn)多功能性，不僅能促進(jìn)細(xì)胞增殖和分化，而且合成和分泌創(chuàng)面愈合所需的多種物質(zhì)[7]。b-FGF作為細(xì)胞有絲分裂刺激原，廣泛分布于體內(nèi)多種細(xì)胞，可促進(jìn)細(xì)胞自身和周圍細(xì)胞的分裂、增殖、分化，改變細(xì)胞的趨化性，增加細(xì)胞遷移，促進(jìn)上皮組織的生成[8-9]。EGF是一種多肽類物質(zhì)，可刺激表皮角質(zhì)細(xì)胞和纖維細(xì)胞增殖，促進(jìn)新血管的形成和核酸蛋白質(zhì)的合成[10-11]。TGF-β主要來源于血小板，對(duì)細(xì)胞的生長(zhǎng)和分化有重要的作用，其中突出的作用為促進(jìn)膠原蛋白等細(xì)胞外基質(zhì)的形成，同時(shí)還能夠抑制蛋白酶和基質(zhì)酶的活性，進(jìn)而促進(jìn)細(xì)胞外基質(zhì)的沉積，是目前已知的與膠原代謝和增生性瘢痕形成關(guān)系最為密切的生長(zhǎng)因子。組織損傷后，血小板在受損組織脫顆粒釋放TGF-β。TGF-β的自身誘導(dǎo)作用又可使激活的巨噬細(xì)胞、T淋巴細(xì)胞、增殖的上皮細(xì)胞和成纖維細(xì)胞表達(dá)TGF-β，加強(qiáng)并延長(zhǎng)TGF-β的作用[12-13]。

實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果顯示，與模型組相比，給藥3 d后，水飛薊醇提物可明顯提高小鼠燙傷模型創(chuàng)面愈合率，起效較快，給藥21 d各組創(chuàng)面愈合率均達(dá)到92%以上，效果明顯。同時(shí)給藥3 d后水飛薊三個(gè)劑量組均能不同程度升高血清中SOD活性，降低血清中MDA含量，且差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;燙傷后第7、14天，水飛薊大劑量組治療作用最為明顯，說明受試藥物抗?fàn)C傷作用機(jī)制與抗氧化和清除自由基高度相關(guān)，且呈現(xiàn)出一定的量效關(guān)系，這與本課題組前期相關(guān)研究結(jié)果一致[14-15]。燒燙傷修復(fù)是個(gè)復(fù)雜有序的生物學(xué)過程，中藥制劑可以通過促進(jìn)b-FGF、EGF、TGF-β等生長(zhǎng)因子的分泌與釋放，加速不同深度燒燙傷創(chuàng)面及供皮區(qū)愈合，特別是對(duì)深Ⅱ度創(chuàng)面作用更為明顯，其中成纖維細(xì)胞的增殖是創(chuàng)面愈合中的關(guān)鍵步驟[16-19]。本實(shí)驗(yàn)對(duì)皮膚組織進(jìn)行了免疫組化定性分析，染色后光鏡下圖形分析結(jié)果顯示，水飛薊噴霧劑各劑量組均可不同程度誘導(dǎo)受損組織內(nèi)bFGF、EGF、TGF-β的表達(dá)，從而促進(jìn)創(chuàng)面的愈合。因本課題后續(xù)研究還將采用western法定量檢測(cè)組織蛋白，故本實(shí)驗(yàn)未對(duì)切片進(jìn)行定量分析。

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