白耙齒菌固體發(fā)酵物對(duì)慶大霉素所致大鼠急性腎衰竭的改善作用研究

李昂 黃靜 劉旭 步洪石 劉馨晨 王淑敏

中圖分類號(hào) R285.5 文獻(xiàn)標(biāo)志碼 A 文章編號(hào) 1001-0408（2018）13-1772-04

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2018.13.11

摘 要 目的：研究白耙齒菌固體發(fā)酵物對(duì)慶大霉素（GM）所致大鼠急性腎衰竭的改善作用。方法：將50只大鼠隨機(jī)分為空白對(duì)照組、模型組、陽性對(duì)照組（尿毒清顆粒，2 g/kg）和白耙齒菌固體發(fā)酵物低、高劑量組（2、4 g/kg），每組10只。除空白對(duì)照組外，其余各組大鼠均連續(xù)7d腹腔注射GM（140 mg/kg）復(fù)制急性腎衰竭模型。給藥組大鼠每天在造模2 h后灌胃給藥1次，空白對(duì)照組和模型組在相應(yīng)時(shí)間灌胃等量生理鹽水；造模結(jié)束后，各組大鼠再連續(xù)給藥7 d，每天給藥1次。給藥結(jié)束后，檢測(cè)大鼠血肌酐（Scr）、血尿素氮（BUN）、尿肌酐（Ucr）和右腎組織中白細(xì)胞介素6（IL-6）、腫瘤壞死因子α（TNF-α）含量，蘇木精-伊紅染色后觀察大鼠左腎組織病理學(xué)變化。結(jié)果：與空白對(duì)照組比較，模型組大鼠Scr、BUN、Ucr和右腎組織中IL-6、TNF-α含量均顯著增加（P<0.01）；左腎組織發(fā)生腎小管上皮細(xì)胞明顯水腫、變性、細(xì)胞核消失以及管腔內(nèi)蛋白樣沉積增多等病理學(xué)變化。與模型組比較，陽性對(duì)照組大鼠Ucr和白耙齒菌固體發(fā)酵物低劑量組大鼠BUN以及白耙齒菌固體發(fā)酵物高劑量組大鼠Scr、BUN、Ucr含量均顯著減少（P<0.05或P<0.01）；同時(shí)給藥組大鼠右腎組織中IL-6、TNF-α含量均顯著減少（P<0.05或P<0.01）；左腎組織的炎癥浸潤減輕、腎小管和血管的增生受到抑制，病理學(xué)變化得到明顯改善。結(jié)論：白耙齒菌固體發(fā)酵物對(duì)GM所致急性腎衰竭具有一定的改善作用。

關(guān)鍵詞 白耙齒菌；固體發(fā)酵物；急性腎衰竭；慶大霉素；大鼠

ABSTRACT OBJECTIVE： To study the improvement effects of Irpex lacteus solid fermentation products on gentamycin （GM）-induced acute renal failure in rats. METHODS： Fifty rats were randomly divided into blank control group， model group， positive control group （Niaoduqing granule， 2 g/kg） and Irpex lacteus solid fermentation products low-dose and high-dose groups （2， 4 g/kg）， with 10 rats in each group. Except for blank control group， other groups were given GM （140 mg/kg） intraperitoneally for consecutive 7 d to induce acute renal failure model. Administration group was given relevant medicine intragastrically 2 h after modeling， once a day. Blank control group and model group were given constant volume of normal saline at corresponding time. After modeling， each group was given relevant medicine for consecutive 7 d， once a day. After medication， the contents of Scr， BUN， Ucr and IL-6， TNF-α in right renal tissue were detected. The pathological changes of left renal tissue was observed by HE staining. RESULTS： Compared with blank control group， the contents of Scr， BUN， Ucr and IL-6， TNF-α in right renal tissue were increased significantly in model group （P<0.01）. The pathological changes of left renal tissue were observed， such as obvious renal tubular epithelial cell edema， degeneration， nucleus disappearance and the increase of protein-like deposition in the lumen. Compared with model group， the content of Ucr in positive control group and the content of BUN in I. lacteus solid fermentation products low-dose group and the contents of Scr， BUN， Ucr in I. lacteus solid fermentation products high-dose group were decreased significantly （P<0.05 or P<0.01）； meanwhile， the contents of IL-6 and TNF-α in right renal tissue were decreased significantly in administration groups （P<0.05 or P<0.01）. The inflammatory infiltration of left renal tissue was relieved， and renal tubules and vessels hyperplasia were inhibited； the pathological changes were improved significantly. CONCLUSIONS： I. lacteus solid fermentation products could improve GM-induced acute renal failure to certain extent.

KEYWORDS Irpex lacteus； Solid fermentation products； Acute renal failure； Gentamicin； Rats

慶大霉素（Gentamicin，GM）是臨床常用的抗感染藥物，因其以原型由腎排泄，使藥物大量蓄積在腎皮質(zhì)[1-3]，這不僅增加了治療的風(fēng)險(xiǎn)，也限制了GM 的臨床應(yīng)用。GM易引起腎損傷與功能性障礙，在所致腎損傷過程中，有大量促炎因子和趨化因子參與，并伴隨炎癥反應(yīng)的發(fā)生。白耙齒菌（Irpex lacteus）又名白囊耙齒菌，屬于多孔菌目（Polyporales）皺孔菌科（Meruliaceae）耙齒菌屬（Irpex）的一種藥用真菌，生于闊葉樹的枯立木、枯枝上，民間常用于治療腎小球腎炎[4-5]。由于白耙齒菌在修復(fù)腎小球炎性損傷方面具有較好的功效，故本研究擬通過大鼠連續(xù)7 d腹腔注射GM建立急性腎衰竭模型，研究白耙齒菌固體發(fā)酵物對(duì)急性腎衰竭的改善作用，為白耙齒菌臨床應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料

1.1 儀器

AUY220型精密電子天平（日本島津公司）；TGL16M型臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)（湖南凱大科學(xué)儀器有限公司）；CX31型生物顯微鏡（上海奮業(yè)光電儀器設(shè)備有限公司）；FLUOstar Omega型全自動(dòng)多功能酶標(biāo)儀（廣州伯齊科技有限公司）。

1.2 藥品與試劑

尿毒清顆粒（廣州康晨藥業(yè)有限公司，批號(hào)：20150419，規(guī)格：5 g/包，給藥前用生理鹽水分散）；硫酸慶大霉素注射液（河南潤弘制藥股份有限公司，批號(hào)：1603101，規(guī)格：2 mL ∶ 4萬單位）；血肌酐（Scr）、血尿素氮（BUN）、尿肌酐（Ucr）試劑盒和白細(xì)胞介素6（IL-6）、腫瘤壞死因子α（TNF-α）酶聯(lián)免疫吸附（ELISA）試劑盒（南京建成生物工程研究所，批號(hào)：均為20160906）。

1.3 動(dòng)物

健康清潔級(jí)SD大鼠50只，♂，體質(zhì)量180～220 g，由遼寧生物制品有限責(zé)任公司提供，動(dòng)物生產(chǎn)合格證號(hào)：SCXK（遼）2015-0001。動(dòng)物飼養(yǎng)觀察環(huán)境的溫度為24～25 ℃，濕度為（60±10）%。

1.4 菌株

白耙齒菌CZ-81保存于長春中醫(yī)藥大學(xué)菌物藥研究室。

2 方法

2.1 白耙齒菌固體發(fā)酵物的制備

將薏米和麥麩以2 ∶ 1的質(zhì)量比混合，滅菌后制成培養(yǎng)基。將白耙齒菌CZ-81接種于培養(yǎng)基上，25 ℃條件下培養(yǎng)，待其長滿培養(yǎng)基后，烘干，粉碎，即得（給藥前用生理鹽水分散）。

2.2 分組、造模與給藥

將大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后隨機(jī)分為5組，分別為空白對(duì)照組（生理鹽水）、模型組（生理鹽水）、陽性對(duì)照組（尿毒清顆粒，2 g/kg，為臨床用量的等效劑量）和白耙齒菌固體發(fā)酵物低、高劑量組[2、4 g/kg，根據(jù)臨床益腎康膠囊（白耙齒菌液體發(fā)酵物的出膏率約40%）服用量（1.2～1.8 g/d）換算而得]，每組10只。除空白對(duì)照組大鼠注射生理鹽水外，其余各組大鼠均每天腹腔注射GM（140 mg/kg）1次，連續(xù)注射7 d，制備急性腎衰竭模型[6-10]。每天在注射GM 2 h后，灌胃給藥，連續(xù)給藥7 d。在造模結(jié)束后，大鼠再連續(xù)給藥7 d，共給藥14 d。

2.3 標(biāo)本采集

在實(shí)驗(yàn)第13天，大鼠禁食不禁水24 h，收集大鼠尿液，記錄尿量。在實(shí)驗(yàn)第14天，給藥4 h后用水合氯醛將大鼠麻醉，腹主動(dòng)脈取血，將血液在4 ℃ 條件下以4 037×g離心10 min，取血清備用。取血后將大鼠處死，迅速取兩側(cè)全腎，左腎固定在10%中性福爾馬林中，備用。所有尿液、血清和右腎樣本均置于-80 ℃冰箱中凍存，待檢。

2.4 生化指標(biāo)檢測(cè)

取血清，采用苦味酸比色法測(cè)定其中Scr含量，二乙酰肟法測(cè)定其中BUN含量；取尿液，采用苦味酸比色法測(cè)定其中Ucr含量；取右腎制成10%腎皮質(zhì)勻漿，ELISA法測(cè)定腎組織中IL-6、TNF-α含量。以上操作均按照相應(yīng)試劑盒說明書進(jìn)行。

2.5 腎組織病理學(xué)觀察

取用10%中性福爾馬林固定24 h后的左腎組織，常規(guī)石蠟包埋切片（厚度4 ?m），用二甲苯脫蠟，梯度乙醇漂洗，切片用蘇木精-伊紅（HE）染色，然后在顯微鏡下觀察腎組織病理變化。

2.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用GraphPad prism 5統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。數(shù)據(jù)以x±s表示，采用單因素方差分析，方差齊性組間比較采用LSD檢驗(yàn)，方差不齊時(shí)采用秩和檢驗(yàn)進(jìn)行組間比較。P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 大鼠生化指標(biāo)測(cè)定結(jié)果

與空白對(duì)照組比較，模型組大鼠Scr、BUN、Ucr含量均顯著增加（P<0.01）；與模型組比較，陽性對(duì)照組大鼠Ucr和白耙齒菌固體發(fā)酵物低劑量組大鼠BUN以及白耙齒菌固體發(fā)酵物高劑量組大鼠Scr、BUN、Ucr含量均顯著減少（P<0.05或P<0.01）。各組大鼠Scr、BUN、Ucr含量測(cè)定結(jié)果見表1。

3.2 右腎組織中IL-6、TNF-α含量測(cè)定結(jié)果

與空白對(duì)照組比較，模型組大鼠右腎組織中IL-6、TNF-α含量顯著增加（P<0.05）；與模型組比較，陽性對(duì)照組和白耙齒菌固體發(fā)酵物低、高劑量組大鼠右腎組織中IL-6、TNF-α含量均顯著減少（P<0.05或P<0.01）。各組大鼠右腎組織中IL-6、TNF-α含量測(cè)定結(jié)果見表2。

3.3 病理學(xué)觀察結(jié)果

與空白對(duì)照組比較，模型組大鼠左腎組織病變非常明顯，腎小管上皮細(xì)胞具有明顯的病變、水腫、變形或細(xì)胞核消失癥狀，而且小血管高度擴(kuò)張，管腔內(nèi)蛋白樣沉積物增多，腎小管有壞死并伴有間質(zhì)纖維化程度加深，腎間質(zhì)炎性細(xì)胞有灶性浸潤。與模型組比較，陽性對(duì)照組大鼠左腎組織病理病變不明顯，偶見腎小管上皮細(xì)胞水腫和變形；白耙齒菌固體發(fā)酵物低劑量組大鼠腎小管擴(kuò)張不明顯，腎間質(zhì)出現(xiàn)少量炎癥浸潤，改善效果明顯；白耙齒菌固體發(fā)酵物高劑量組大鼠血管擴(kuò)張不明顯，未見腎小管上皮細(xì)胞明顯水腫、變形，改善效果要優(yōu)于陽性對(duì)照組。各組大鼠左腎組織病理切片見圖1。

4 討論

模型組大鼠連續(xù)7 d腹腔注射GM后，尿量呈上升趨勢(shì)，Scr、BUN、Ucr的含量均增加，與空白對(duì)照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。其中，Scr和BUN含量是衡量腎功能正常與否的重要指標(biāo)。本研究結(jié)果提示，模型大鼠的腎小球?yàn)V過功能和腎小管重吸收功能同時(shí)受損，這與文獻(xiàn)報(bào)道的GM可引起大鼠非少尿型的急性腎衰竭一致[8]，證明模型建立成功。白耙齒菌固體發(fā)酵物高劑量組大鼠Scr、BUN、Ucr的含量比模型組顯著降低（P<0.05），提示白耙齒菌固體發(fā)酵物具有減輕腎小球和腎小管功能受損的作用。病理結(jié)果也顯示，給予白耙齒菌發(fā)酵物后模型大鼠腎間質(zhì)炎性細(xì)胞灶性浸潤減輕，白耙齒菌發(fā)酵物高劑量組大鼠未見腎小管上皮細(xì)胞明顯水腫、變形。同時(shí)，給藥組大鼠腎組織中的炎癥因子IL-6和TNF-α的含量比模型組明顯降低（P<0.05或P<0.01）。由此可以說明，白耙齒菌固體發(fā)酵物可有效抑制腎組織炎癥反應(yīng)，具有抑制腎損傷的作用，可用于防治急性腎衰竭。

中成藥尿毒清顆粒是臨床用于治療腎衰竭的常用藥物，適用于氮質(zhì)血癥期、尿毒癥早期以及中醫(yī)辨證屬脾虛濕濁癥和脾虛血瘀癥者，可降低Scr、BUN含量和穩(wěn)定腎功能、減少蛋白尿的排泄、抑制腎小管上皮細(xì)胞表型轉(zhuǎn)化、延緩腎纖維化等[11-13]，因此本研究以其為陽性對(duì)照藥。從本研究結(jié)果可以看出，不管是Scr、BUN、Ucr的含量，還是腎組織中炎癥因子IL-6和TNF-α的含量，白耙齒菌固體發(fā)酵物組大鼠的變化均優(yōu)于給予尿毒清顆粒的陽性對(duì)照組，尤其是白耙齒菌固體發(fā)酵物高劑量組。本實(shí)驗(yàn)中有的實(shí)驗(yàn)組存在組間數(shù)據(jù)偏差過大的情況，這可能是由于大鼠個(gè)體差異帶來的異常值。

綜上所述，白耙齒菌固體發(fā)酵物在治療氨基糖苷類抗生素（如GM）所致的急性腎衰竭方面具有開發(fā)價(jià)值，本研究為今后白耙齒菌固體發(fā)酵物的臨床應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)，也為保腎藥物的研發(fā)提供了科學(xué)依據(jù)。

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（收稿日期：2017-12-04 修回日期：2018-05-15）

（編輯：林 靜）