HPLC—DAD法同時(shí)測(cè)定肝康復(fù)水丸劑中7個(gè)成分的含量

侯玉華 袁龍 趙功寶 黃培池 楊慧 曹媛 張洪

摘 要 目的：建立同時(shí)測(cè)定肝康復(fù)水丸劑中沒(méi)食子酸、梔子苷、芍藥內(nèi)酯苷、芍藥苷、丹酚酸B、丹皮酚和丹參酮ⅡA含量的方法。方法：采用高效液相色譜（HPLC）法，以二極管陣列檢測(cè)器（DAD），色譜柱為Agilent ZORBAX SB-C18；流動(dòng)相A為乙腈，流動(dòng)相B為0.1%磷酸溶液，梯度洗脫；流速為1.0 mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)為267 nm（沒(méi)食子酸）、235 nm（梔子苷、芍藥內(nèi)酯苷、芍藥苷）、286 nm（丹酚酸B）、274 nm（丹皮酚）、270 nm（丹參酮ⅡA）；柱溫為30 ℃；進(jìn)樣量為10 μL。結(jié)果：沒(méi)食子酸、梔子苷、芍藥內(nèi)酯苷、芍藥苷、丹酚酸B、丹皮酚、丹參酮ⅡA檢測(cè)質(zhì)量濃度的線性范圍分別為4.09～51.17 μg/mL（r=0.999 5）、8.35～104.35 μg/mL（r= 0.999 1）、7.78～97.25 μg/mL（r=0.999 9）、7.56～94.54 μg/mL（r=0.999 3）、16.70～208.80 μg/mL（r=0.999 5）、3.46～43.20 μg/mL（r=0.999 7）、23.13～289.10 μg/mL（r=0.999 9），檢測(cè)限分別為0.09、0.15、0.13、0.12、0.16、0.04、0.24 μg/mL，定量限分別為0.26、0.52、0.48、0.47、0.88、0.18、0.98 μg/mL，平均回收率分別為91.83%、96.11%、96.83%、95.82%、96.93%、93.95%、94.79%（n=6），精密度試驗(yàn)的RSD均≤1.00%（n=6），供試品溶液48 h內(nèi)穩(wěn)定性試驗(yàn)的RSD均≤0.96%（n=6），重復(fù)性試驗(yàn)的RSD均≤0.99%（n=6）。結(jié)論：本方法準(zhǔn)確、可靠，可用于肝康復(fù)水丸劑中上述7個(gè)成分的含量測(cè)定。

關(guān)鍵詞 高效液相色譜法；二極管陣列檢測(cè)器；肝康復(fù)水丸劑；沒(méi)食子酸；梔子苷；芍藥內(nèi)酯苷；芍藥苷；丹酚酸B；丹皮酚；丹參酮ⅡA；含量測(cè)定

中圖分類號(hào) R927.2 文獻(xiàn)標(biāo)志碼 A 文章編號(hào) 1001-0408（2018）21-2907-05

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2018.21.07

ABSTRACT OBJECTIVE： To establish a method for simultaneous determination of the contents of gallic acid， jasminoidin， albiflorin， paeoniflorin， danshinolic acid B， paeonol and tanshinone ⅡA in Gankangfu water pill. METHODS： HPLC method with DAD was adopted. The determination was performed on Agilent ZORBAX SB-C18 column with mobile phase A consisted of acetonitrile and mobile phase B consisted of 0.1% phosphate solution （gradient elution） at the flow rate of 1.0 mL/min. The detection wavelengths were set at 267 nm （gallic acid）， 235 nm （jasminoidin， albiflorin， paeoniflorin）， 286 nm （danshinolic acid B）， 274 nm （paeonol） and 270 nm （tanshinone ⅡA） . The column temperature was set at 30 ℃ and sample size was 10 μL. RESULTS： The linear range of gallic acid， jasminoidin， albiflorin， paeoniflorin， danshinolic acid B， paeonol and tanshinone ⅡA were 4.09-51.17 μg/mL （r=0.999 5）， 8.35-104.35 μg/mL （r=0.999 1）， 7.78-97.25 μg/mL （r=0.999 9）， 7.56-94.54 μg/mL （r=0.999 3）， 16.70-208.80 μg/mL （r=0.999 5）， 3.46-43.20 μg/mL （r=0.999 7）， 23.13-289.10 μg/mL （r=0.999 9）， respectively. The detection limits were 0.09， 0.15， 0.13， 0.12， 0.16， 0.04 and 0.24 μg/mL； quantitative limits were 0.26， 0.52， 0.48， 0.47， 0.88， 0.18 and 0.98 μg/mL， respectively. The average recovery rates were 91.83%， 96.11%， 96.83%， 95.82%， 96.93%， 93.95% and 94.79%， respectively （n=6）. RSDs of precision test were not more than 1.00% （n=6）. RSDs of stability test were not more than 0.96% within 48 h （n=6）， and RSDs of repeatability test were than 0.99% （n=6）. CONCLUSIONS： The method is accurate and reliable， and can be used for content determination of above 7 components in Gankangfu water pill.

KEYWORDS HPLC； DAD； Gankangfu water pill； Gallic acid； Jasminoidin； Albiflorin； Paeoniflorin； Danshinolic acid B； Paeonol； Tanshinone ⅡA； Content determination

肝康復(fù)水丸劑（批準(zhǔn)文號(hào)：蘇藥制字Z04001632，后文簡(jiǎn)稱肝康復(fù)）屬于徐州中醫(yī)院自制丸劑，是由多種中藥經(jīng)提取、精制而成的純中藥復(fù)方制劑，臨床上主要用于病毒性肝炎的治療，其功效為疏肝理氣和健脾、胃[1]。肝康復(fù)由炒梔子、白芍、丹皮、丹參、柴胡、香附、當(dāng)歸、白術(shù)、川樸、郁金、龍膽草、香附、甘草等多味中藥組成，其中白芍為君藥，其主要成分包括芍藥苷、芍藥內(nèi)酯苷、丹皮酚、沒(méi)食子酸、苯甲酸；炒梔子為臣藥，其主要成分包括梔子苷、梔子新苷、熊果酸；丹參為佐藥，其主要成分包括丹酚酸B、隱丹參酮、丹參酮ⅡA、丹參酮Ⅰ；丹皮為使藥，其主要成分包括芍藥苷、丹皮酚、沒(méi)食子酸。肝康復(fù)成分復(fù)雜，為了保證其藥品質(zhì)量，對(duì)多組分進(jìn)行含量測(cè)定以控制藥品質(zhì)量尤其重要。

沒(méi)食子酸、梔子苷、芍藥內(nèi)酯苷、芍藥苷、丹酚酸B、丹皮酚、丹參酮ⅡA作為肝康復(fù)的主要活性成分，尚未見(jiàn)同時(shí)測(cè)定其含量的報(bào)道。本研究擬采用高效液相色譜（HPLC）法，以二極管陣列檢測(cè)器（DAD）多波長(zhǎng)變換同時(shí)測(cè)定肝康復(fù)中上述7個(gè)活性成分的含量，旨在為肝康復(fù)的質(zhì)量控制提供參考。

1 材料

1.1 儀器

1200 HPLC儀，包括G1312A四元梯度泵、G1329自動(dòng)進(jìn)樣儀、G1316柱溫箱、G1315D DAD、Agilent色譜工作站（美國(guó)Agilent公司）； XS105十萬(wàn)分之一天平和EL104電子分析天平（瑞士Mettler-Toledo公司）；As3120雙頻數(shù)控超聲波清洗儀（天津奧特賽斯儀器有限公司）；3K15高速冷凍離心機(jī)（美國(guó)Sigma公司）。

1.2 藥品與試劑

肝康復(fù)水丸劑（徐州市中醫(yī)院自制制劑，批號(hào)：151027、160323、170420、171222，規(guī)格：60 g/瓶）；沒(méi)食子酸對(duì)照品（批號(hào)：110831-201605，純度：90.8%）、梔子苷對(duì)照品（批號(hào)：110749-201316，純度：97.5%）、芍藥苷對(duì)照品（批號(hào)：110736-201640，純度：95.2%）、丹酚酸B對(duì)照品（批號(hào)：111562-201212，純度：95.4%）、丹皮酚對(duì)照品（批號(hào)：11708-201407，純度：99.9%）、丹參酮ⅡA對(duì)照品（批號(hào)：110766-201520，純度：98.9%）均由中國(guó)食品藥品檢定研究院提供；芍藥內(nèi)酯苷對(duì)照品（上海安譜實(shí)驗(yàn)科技股份有限公司，批號(hào)：76610010，純度：95.2%）；甲醇、乙腈為進(jìn)口色譜純；水為屈臣氏純凈水；其余試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱：Agilent ZORBAX SB-C18（250 mm×4.6 mm， 5 ?m）；流動(dòng)相A：乙腈，流動(dòng)相B：0.1%磷酸溶液，梯度洗脫（0 min，2%A；0～10 min，5%A；10～20 min，10%A；20～30 min，15%A；30～40 min，20%A；40～50 min，30%A；50～60 min，80%A；60～80 min，80%A）；流速：1.0 mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)：267 nm（沒(méi)食子酸）、235 nm（梔子苷、芍藥內(nèi)酯苷、芍藥苷）、286 nm（丹酚酸B）、274 nm（丹皮酚）、270 nm丹參酮ⅡA；柱溫：30 ℃；進(jìn)樣量：10μL。

2.2 溶液的制備

2.2.1 對(duì)照品貯備液 分別精密稱取沒(méi)食子酸、梔子苷、芍藥內(nèi)酯苷、芍藥苷、丹酚酸B、丹皮酚、丹參酮ⅡA對(duì)照品適量，加70%甲醇溶液制成沒(méi)食子酸2.132 mg/mL、梔子苷0.434 8 mg/mL、芍藥內(nèi)酯苷0.810 4 mg/mL、芍藥苷1.131 mg/mL、丹酚酸B1.741 mg/mL、丹皮酚0.720 0 mg/mL、丹參酮ⅡA 0.803 mg/mL的溶液作為各對(duì)照品貯備液。

2.2.2 混合對(duì)照品溶液 分別精密移取“2.2.1”項(xiàng)下的7種對(duì)照品貯備液各適量，置于同一25 mL量瓶中，加甲醇定容搖勻，稀釋成沒(méi)食子酸51.17 ?g/mL、梔子苷104.4 ?g/mL、芍藥內(nèi)酯苷97.25 ?g/mL、芍藥苷94.54 ?g/mL、丹酚酸B 208.8 ?g/mL、丹皮酚43.20 ?g/mL、丹參酮ⅡA 289.1 ?g/mL的混合對(duì)照品溶液。

2.2.3 供試品溶液 精密稱取肝康復(fù)粉末（過(guò)30目篩）約1.0 g，置于100 mL具塞錐形瓶中，精密加入70%甲醇50 mL后稱質(zhì)量，超聲（功率300 W，頻率40 kHz）30 min，放冷，再稱質(zhì)量，用70%甲醇溶液補(bǔ)足減失質(zhì)量后，于12 000 r/min離心5 min，過(guò)濾，取續(xù)濾液即得供試品溶液。

2.2.4 陰性對(duì)照溶液 參照肝康復(fù)制備工藝和配方比例，分別制備缺白芍、丹皮陰性樣品、缺梔子陰性樣品、缺丹參陰性樣品，再按“2.2.3”項(xiàng)下方法制成陰性對(duì)照溶液。

2.3 系統(tǒng)適用性與專屬性試驗(yàn)

分別精密吸取“2.2”項(xiàng)下混合對(duì)照品溶液、供試品溶液（批號(hào)：170420）、陰性對(duì)照溶液各10 ?L，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄色譜。結(jié)果顯示，該色譜條件下沒(méi)食子酸、梔子苷、芍藥內(nèi)酯苷、芍藥苷、丹酚酸B、丹皮酚、丹參酮ⅡA的色譜峰的峰形均較好，均能達(dá)到基線分離（分離度均大于1.5），拖尾因子在0.95～1.05之間，理論板數(shù)按梔子苷峰計(jì)不低于5 000。色譜圖見(jiàn)圖1。

2.4 線性關(guān)系考察

精密吸取“2.2.2”項(xiàng)下混合對(duì)照品溶液0.4、0.5、1、2、3、4、5 mL，分別置于5 mL量瓶中，加70%甲醇稀釋、定容至刻度，搖勻，即得上述線性混合對(duì)照品溶液。精密吸取上述溶液各10 μL，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積，以對(duì)照品的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（x），峰面積為縱坐標(biāo)（y），進(jìn)行線性回歸分析。回歸方程、相關(guān)系數(shù)（r）與線性范圍見(jiàn)表1。

2.5 檢測(cè)限與定量限考察

取“2.2.2”項(xiàng)下混合對(duì)照品溶液，倍比稀釋，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣測(cè)定6次，記錄峰面積。當(dāng)信噪比為3 ∶ 1時(shí)得檢測(cè)限；當(dāng)信噪比為10 ∶ 1得定量限。結(jié)果顯示，沒(méi)食子酸、梔子苷、芍藥內(nèi)酯苷、芍藥苷、丹酚酸B、丹皮酚和丹參酮ⅡA的檢測(cè)限分別為0.09、0.15、0.13、0.12、0.16、0.04、0.24 μg/mL，定量限分別為0.26、0.52、0.48、0.47、0.88、0.18、0.98 μg/mL。

2.6 精密度試驗(yàn)

精密吸取“2.2.2”項(xiàng)下混合對(duì)照品溶液，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6次，記錄峰面積。結(jié)果顯示，沒(méi)食子酸、梔子苷、芍藥內(nèi)酯苷、芍藥苷、丹酚酸B、丹皮酚和丹參酮ⅡA峰面積的RSD分別為0.94%、0.63%、0.74%、1.00%、0.89%、0.52%和0.90%（n=6）。

2.7 穩(wěn)定性試驗(yàn)

精密吸取同一批供試品溶液（批號(hào)：170420），在室溫下放置0、4、8、12、24、48 h后，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積。結(jié)果顯示，沒(méi)食子酸、梔子苷、芍藥內(nèi)酯苷、芍藥苷、丹酚酸B、丹皮酚和丹參酮ⅡA峰面積的RSD分別為0.54%、0.72%、0.82%、0.62%、0.51%、0.40%和0.96%（n=6），表明供試品溶液在室溫下48 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.8 重復(fù)性試驗(yàn)

取同一批肝康復(fù)（批號(hào)：170420）6份，分別按“2.2.3”項(xiàng)下方法制備成供試品溶液，再按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積，計(jì)算含量。結(jié)果顯示，沒(méi)食子酸、梔子苷、芍藥內(nèi)酯苷、芍藥苷、丹酚酸B、丹皮酚和丹參酮ⅡA的平均含量分別為0.156 7、0.477 4、0.228 8、0.456 4、0.936 9、0.101 2、1.349 3 mg/g，RSD分別為0.99%、0.47%、0.80%、0.86%、0.49%、0.48%和0.45%（n=6），表明該方法重復(fù)性較好。

2.9 準(zhǔn)確度試驗(yàn)

精密稱取0.5 g已知含量（沒(méi)食子酸0.156 7 mg/g、梔子苷0.477 4 mg/g、芍藥內(nèi)酯苷0.228 8 mg/g、芍藥苷0.456 4 mg/g、丹酚酸B 0.936 9 mg/g、丹皮酚0.101 2 mg/g、丹參酮ⅡA 1.349 3 mg/g）的肝康復(fù)（批號(hào)：170420）6份，分別精密加入各對(duì)照品貯備液（沒(méi)食子酸0.04 mL、梔子苷0.6 mL、芍藥內(nèi)酯苷0.15 mL、芍藥苷0.18 mL、丹酚酸B 0.3 mL、丹皮酚0.7 mL和丹參酮ⅡA 0.9 mL），按“2.2.3”項(xiàng)下方法制成供試品溶液，再按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積，計(jì)算回收率，結(jié)果見(jiàn)表2。

2.10 樣品含量測(cè)定

取3批肝復(fù)康各適量，按“2.2.3”項(xiàng)下方法制成供試品溶液，再按“2.1”項(xiàng)下色譜條件分別進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積，計(jì)算沒(méi)食子酸、梔子苷、芍藥內(nèi)酯苷、芍藥苷、丹酚酸B、丹皮酚和丹參酮ⅡA的含量，結(jié)果見(jiàn)表3。

3 討論

3.1 流動(dòng)相選擇

在文獻(xiàn)[2-8]基礎(chǔ)上進(jìn)一步優(yōu)化色譜條件，分別考察了不同有機(jī)流動(dòng)相（甲醇和乙腈）對(duì)結(jié)果的影響，結(jié)果顯示，甲醇作為有機(jī)流動(dòng)相，樣品組分分離不充分，尤其是沒(méi)食子酸與樣品其他組分不能分離，干擾較大，所以選擇乙腈為有機(jī)流動(dòng)相。選擇水相時(shí)，首先考慮了純水、磷酸、磷酸鹽緩沖液，結(jié)果顯示，0.1%磷酸溶液可顯著提高各組分峰形對(duì)稱性及分離度，經(jīng)大量試驗(yàn)確定本文的最優(yōu)流動(dòng)相、梯度洗脫方案。

3.2 檢測(cè)波長(zhǎng)選擇

筆者前期試驗(yàn)采用DAD在200～400 nm范圍內(nèi)對(duì)沒(méi)食子酸、梔子苷、芍藥內(nèi)酯苷、芍藥苷、丹酚酸B、丹皮酚和丹參酮ⅡA 7個(gè)成分進(jìn)行光譜掃描，結(jié)果顯示，其最大吸收波長(zhǎng)分別為215/260、238、230、230、203/286、212/274、224/270 nm?？紤]樣品溶劑含有甲醇，甲醇在215、203、212、224 nm波長(zhǎng)處有部分紫外吸收會(huì)帶來(lái)定量誤差，所以沒(méi)有選擇215、203、212、224 nm作為紫外檢測(cè)波長(zhǎng)。再則筆者發(fā)現(xiàn)沒(méi)食子酸在260 nm波長(zhǎng)處樣品基線不穩(wěn)且色譜峰峰形對(duì)稱性不好，故參考文獻(xiàn)[9]選擇了267 nm波長(zhǎng)作為沒(méi)食子酸的紫外檢測(cè)波長(zhǎng)，以滿足定量分析要求。梔子苷、芍藥內(nèi)酯苷、芍藥苷分別在238、230、230 nm波長(zhǎng)處各有最大吸收，但因這3個(gè)成分保留時(shí)間相差太近，波長(zhǎng)切換太頻繁，故選擇235 nm波長(zhǎng)作為這3個(gè)成分的紫外檢測(cè)波長(zhǎng)，且此波長(zhǎng)對(duì)3個(gè)成分的含量測(cè)定無(wú)影響。其余3個(gè)成分丹酚酸B、丹皮酚和丹參酮ⅡA的紫外檢測(cè)波長(zhǎng)分別為286、274、270 nm?？紤]到7個(gè)成分的紫外吸收波長(zhǎng)相差過(guò)大，故本試驗(yàn)采用梯度洗脫波長(zhǎng)切換實(shí)現(xiàn)7個(gè)成分的含量同時(shí)測(cè)定。

3.3 樣品提取條件選擇

樣品處理首先參考了2015年版《中國(guó)藥典》的處理方法[10]，但此制劑中丹皮酚含量濃度特別少，丹參酮ⅡA成分含量較高，不能滿足定量分析要求。本試驗(yàn)用水、30%甲醇、50%甲醇、70%甲醇、100%甲醇、50%乙醇、70%乙醇和中性乙醇作為提取溶劑，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，用70%甲醇溶液提取效率高。同時(shí)考察提取方式（超聲和加熱回流），結(jié)果發(fā)現(xiàn)，超聲提取與回流提取效率沒(méi)有顯著差別，其中超聲提取較簡(jiǎn)便、快捷。另外對(duì)比了超聲時(shí)間15、30、40 min及提取溶劑用量，最終選擇超聲提取樣品粉末1.0 g，提取溶劑70%甲醇50 mL超聲30 min，作為供試品的提取方法。

當(dāng)前隨著儀器檢測(cè)手段的不斷發(fā)展，中藥制劑質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)由單一有效成分向多組分體系發(fā)展[11]。本試驗(yàn)建立了同時(shí)測(cè)定肝康復(fù)中沒(méi)食子酸、梔子苷、芍藥內(nèi)酯苷、芍藥苷、丹酚酸B、丹皮酚和丹參酮ⅡA 7個(gè)成分含量的方法，結(jié)果顯示，該法具有簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確、重現(xiàn)性好、靈敏度高的特點(diǎn)，為肝康復(fù)質(zhì)量控制和質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的建立提供了參考方法和依據(jù)。

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（收稿日期：2018-06-23 修回日期：2018-08-30）

（編輯：鄒麗娟）