尖吻鱸仔魚骨骼發(fā)育觀察

周勝杰　馬婷　胡靜　馬振華　楊其彬　陳旭　楊蕊　劉亞娟　孟祥君

摘要：[目的]掌握尖吻鱸仔魚期的骨骼生長發(fā)育規(guī)律，為開展尖吻鱸骨骼發(fā)育相關(guān)基因研究及魚類化石探究提供基礎(chǔ)資料。[方法]采用軟骨一硬骨雙染染色技術(shù)，連續(xù)觀測(cè)0～23日齡尖吻鱸仔魚發(fā)育過程中脊柱及附肢骨骼中的胸鰭、背鰭、腹鰭、尾鰭、臀鰭形成及生長發(fā)育特征。[結(jié)果]1日齡的尖吻鱸全長1.70±0.10 mm，其身體細(xì)長筆直，骨骼尚未開始骨化，附肢骨骼未出現(xiàn)；3日齡時(shí)，尖吻鱸仔魚脊索發(fā)生自然彎曲并開始發(fā)育，胸鰭、尾鰭原基逐漸形成；5日齡時(shí)，尖吻鱸仔魚脊索末端開始向上彎曲，背鰭開始發(fā)育；9日齡時(shí)，尖吻鱸仔魚脊索出現(xiàn)彎曲，髓弓和脈弓開始形成，尾桿骨上翹，隨之形成尾鰭，胸鰭原基、背鰭鰭皺開始出現(xiàn)，臀鰭開始發(fā)育；13日齡時(shí)，尖吻鱸仔魚的胸鰭和尾鰭發(fā)育基本完成，髓棘、脈棘開始出現(xiàn)；15日齡時(shí)，尖吻鱸仔魚的腹鰭開始發(fā)育，背肋和腹肋以軟骨的形式生長，尾桿骨收縮，背鰭和胸鰭進(jìn)入發(fā)育后期；19日齡時(shí)，尖吻鱸仔魚脊柱骨化，胸鰭出現(xiàn)鰭棘，附肢骨骼發(fā)育接近完全；21日齡時(shí)，尖吻鱸仔魚的背肋和腹肋開始骨化，尾鰭骨化基本完成，髓弓、脈弓、髓棘和脈棘也開始骨化；23日齡時(shí)，尖吻鱸仔魚脊柱骨化完全，胸鰭發(fā)育完成，魚體骨骼基礎(chǔ)框架完成發(fā)育，鰭條開始骨化并出現(xiàn)分節(jié)，仔魚完成變態(tài)。脊柱畸形首次出現(xiàn)在10日齡的尖吻鱸仔魚中，至22日齡時(shí)畸形率占樣本采集總量的8%，其中前期畸形的仔魚在14M5日齡時(shí)基本被淘汰。[結(jié)論]尖吻鱸仔魚脊柱及附肢骨的發(fā)育順序與其他魚類基本一致，但發(fā)育時(shí)間節(jié)點(diǎn)有所不同。尖吻鱸仔魚的骨骼發(fā)育畸形首次出現(xiàn)在10日齡左右，但主要集中在20～22日齡。

關(guān)鍵詞：尖吻鱸；仔魚；骨骼發(fā)育；骨化；時(shí)間節(jié)點(diǎn)

中圖分類號(hào)：S965.211 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號(hào)：2095-1191（2018）03-0592-07

0引言

[研究意義]尖吻鱸（Lates calcarifer）隸屬于鱸形目（Perciformes）、鱸亞目（Percoidei）、尖吻鱸科（Latidae）、尖吻鱸屬（Lates），其自然分布以西太平洋熱帶、亞熱帶地區(qū)居多（張邦杰等，1998）。尖吻鱸的魚體延長，呈青灰色，下側(cè)部白色，口大，為肉食性魚類，生長較快，體重可達(dá)70 kg/尾。由于尖吻鱸具有廣鹽性、抗病能力強(qiáng)和生長快速等優(yōu)點(diǎn)，東南亞各國、澳大利亞等爭(zhēng)相發(fā)展尖吻鱸人工養(yǎng)殖。在我國海南、廣東及福建等沿海地區(qū)也有尖吻鱸人工養(yǎng)殖的報(bào)道，并已取得一定成效（趙旺等，2017）。魚類早期骨骼的發(fā)育情況能客觀反映出其魚苗營養(yǎng)攝人是否充足，從而推導(dǎo)出餌料的數(shù)量和質(zhì)量是否充足或達(dá)標(biāo)，因此，觀察研究魚類骨骼的生長發(fā)育規(guī)律，除了能豐富魚類發(fā)育生物學(xué)理論外，對(duì)科學(xué)制定養(yǎng)殖方案也具有重要的參考價(jià)值。[前人研究進(jìn)展]魚類骨骼的形成和發(fā)育直接關(guān)系到其形體發(fā)育，因此通過研究魚類骨骼發(fā)育規(guī)律有助于深入了解魚類功能發(fā)育，同時(shí)獲得導(dǎo)致骨骼畸形發(fā)育的影響因素等信息（鄭攀龍，2015）。至今，已在日本鰻鱺（Anguillajaponica）（Tadahide et a1.，2008；Okamoto et a1.，2009）、赤鯛（Pagrus pagrus）（Roof et a1.，2009）、舌齒鱸（Dicentrarchus labrax）（Darias et a1.，2010）、半滑舌鰨（So/ea senegalensis）（Boglino et a1.，2012）、長尾大眼鯛（Priacanthus tayenus）（李仲輝等，2012）、青石斑魚（Epinephelus awoara）（王秋榮等，2012）、條石鯛（Oplegnathus fasciatus）（區(qū)又君等，2014）、卵形鯧鲹（Trachinotus ovatus）（鄭攀龍等，2014）、美洲鰣（Alosa sapidissima）（鄧平平等，2017）等魚類上開展了骨骼發(fā)育特點(diǎn)及其規(guī)律的相關(guān)研究，其研究方法經(jīng)歷了直接觀察法、內(nèi)臟剔除-肌肉剝離法、肌肉透明處理法到茜素紅-阿利新藍(lán)雙染色法（鄭攀龍，2015），尤其是茜素紅-阿利新藍(lán)雙染色法的出現(xiàn)，能最大程度地保證觀察到發(fā)育過程中的魚類原始形態(tài)，為魚類形態(tài)學(xué)、骨骼發(fā)育、骨骼畸形鑒定、環(huán)境適應(yīng)性分析及分類鑒定等研究提供重要材料依據(jù)。[本研究切入點(diǎn)]目前，有關(guān)尖吻鱸的研究主要集中在養(yǎng)殖技術(shù)（Nankervis and Southgate，2006；張俊等，2012；Ribeiro et a1.，2015）、生理生化（陸鑫等，2009；林黑著等，2010；袁豐華等，2009，2010）、形態(tài)特征（張成鋒等，2008）、營養(yǎng)成分分析（閔寬洪等，2008；許鄭超，2016）、漁業(yè)資源（韓楊等，2014）、病害診斷與防治（文琳等，2015）及其分子生物學(xué)（司李真等，2017）等方面，而針對(duì)尖吻鱸骨骼系統(tǒng)早期發(fā)育與畸形鑒定方面的研究仍是空白。[擬解決的關(guān)鍵問題]采用軟骨一硬骨雙染染色技術(shù)，連續(xù)觀測(cè)0-23日齡尖吻鱸仔魚發(fā)育過程中脊柱及附肢骨骼中的胸鰭、背鰭、腹鰭、尾鰭、臀鰭形成及生長發(fā)育特征，揭示尖吻鱸仔魚期的骨骼生長發(fā)育規(guī)律，為開展尖吻鱸骨骼發(fā)育相關(guān)基因研究及魚類化石探究提供基礎(chǔ)資料。

1材料與方法

1.1尖吻鱸仔魚樣本準(zhǔn)備

尖吻鱸仔魚早期發(fā)育的各階段樣本由中國水產(chǎn)科學(xué)研究院南海水產(chǎn)研究所熱帶水產(chǎn)研究開發(fā)中心通過人工培育養(yǎng)殖獲得。尖吻鱸受精卵購自海南省陵水縣，受精卵放入27-28℃水中預(yù)溫20 min后，緩慢倒入500 L的孵化器中集中孵化，待受精卵破膜后從孵化器中移出，放人800 L的育苗桶中進(jìn)行下一步的培育工作。在育苗階段保持各育苗桶的魚苗數(shù)約20尾/L，光照強(qiáng)度300-3000 lX，水溫29-30℃，鹽度31%0-33%0，pH 7.7-8.1，溶解氧保持在7.5±0.7 mg/L，同時(shí)以氣石充氣增氧，調(diào)整好所需氣量降低氣泡破裂對(duì)魚苗的傷害。育苗桶中部安裝排水管，采取溢流方式排換水，排水口包被80目篩網(wǎng)防止魚苗逃逸。育苗過程中要及時(shí)吸污清底，防止餌料過剩，保持水體清潔。在尖吻鱸魚苗生長發(fā)育階段，隨著魚苗個(gè)體的生長所投喂餌料粒徑逐漸增大，投喂餌料依次為輪蟲、鹵蟲無節(jié)幼體、橈足類等適口的浮游動(dòng)物。孵化后第3 d（尖吻鱸開口階段）投喂輪蟲，投喂密度控制在15000個(gè)/L；9日齡起開始投喂鹵蟲無節(jié)幼體，投喂密度控制在5000個(gè)/L；11日齡以后開始投喂橈足類；20日齡開始進(jìn)行人工餌料馴化，每日投喂4次，且在第2次投喂后補(bǔ)充橈足類，以保證尖吻鱸正常生長的營養(yǎng)需求。根據(jù)魚苗進(jìn)食量，實(shí)時(shí)調(diào)整投喂量。

1.2樣品處理及方法

試驗(yàn)樣品為孵化后0-23日齡的尖吻鱸魚苗，每天于投喂餌料前隨機(jī)挑取5-10尾魚苗，通過解剖鏡目鏡中的測(cè)微尺（mm）進(jìn)行生物學(xué)指標(biāo)測(cè)量（鄧平平等，2017），測(cè)量后的樣本用福爾馬林浸泡避光保存。尖吻鱸骨骼發(fā)育樣品采用軟骨一硬骨雙染染色技術(shù)進(jìn)行染色（張宗鋒等，2015），其操作步驟分為前期處理、軟骨染色和硬骨染色3個(gè)階段。其中，前期處理包括樣品的固定（10%中性甲醛溶液）、脫水（70%-90%的梯度酒精）及透明（2%KOH溶液）；軟骨染色選用阿爾新藍(lán)染液（Alcian blue 8GX，Aladdin Zn-dustrial Corporation），加蒸餾水脫浮色，再用3%H202脫色，預(yù)透明處理后用甘油進(jìn)行梯度漂洗；硬骨染色選用茜素紅（Alizarin red monohvdrate，天津市大茂化學(xué)試劑廠出品），著色后重復(fù)上述的脫浮色、脫色、甘油梯度透明等步驟，最后將處理好的仔魚樣品置于干凈的玻璃瓶中并注入新的純甘油密封保存。

1.3顯微鏡觀察分析

染色處理好的仔魚樣品在Olympus SZ40型生物顯微鏡下進(jìn)行觀察，詳細(xì)記錄仔魚各發(fā)育時(shí)期的骨骼形態(tài)特征變化，同時(shí)應(yīng)用數(shù)碼相機(jī)顯微攝影采集圖像信息，對(duì)尖吻鱸脊椎、脊柱骨骼及背鰭、胸鰭等附肢骨骼發(fā)育的主要形態(tài)特征進(jìn)行連續(xù)觀察，并以Auto CAD 2014測(cè)量脊椎、脊柱長度和拍照，最后采用Photoshop對(duì)拍攝圖片進(jìn)行編輯和處理。

2結(jié)果與分析

2.1尖吻鱸仔魚脊柱及附肢骨的發(fā)育特征

完成基礎(chǔ)發(fā)育后，尖吻鱸脊椎骨24枚，肋骨12對(duì)，有背肋。早期的尖吻鱸仔魚脊索呈管狀，1日齡（圖1-A）的尖吻鱸全長1.70±0.10 mm，其身體細(xì)長筆直，骨骼尚未開始骨化，附肢骨骼未出現(xiàn)，卵黃明顯收縮。3日齡（圖1-B）魚苗全長1.87±0.05 mm，隨著尖吻鱸魚苗生長，脊索發(fā)生自然彎曲，頭部與軀干部呈139°-149°彎曲，脊索周圍開始出現(xiàn)明顯的突起，隨后胸鰭、尾鰭開始發(fā)育，尾鰭原基出現(xiàn)。5日齡（圖1-C）仔魚全長2.03±0.05 mm，脊索末梢形成并開始向上彎曲，隨之出現(xiàn)背鰭原基，并開始出現(xiàn)胸鰭支鰭骨原基，尾鰭快速發(fā)育。魚苗尾鰭發(fā)育速度明顯加快，說明此階段獲得更快的游泳能力是首選發(fā)育方向，游泳能力的提升能大幅度提高獲取餌料和躲避天敵的能力，進(jìn)而提高生存概率。

9日齡（圖1-D）仔魚全長2.73±0.05mm，其脊索出現(xiàn)彎曲，髓弓、脈弓開始出現(xiàn)于表面，脊柱開始發(fā)育，軟骨質(zhì)背鰭支鰭骨也開始出現(xiàn)；尾桿骨形成并呈明顯上翹趨勢(shì)，隨之尾鰭初步形成；背鰭發(fā)育進(jìn)入快速階段，胸鰭原基、背鰭鰭皺開始出現(xiàn)，泄殖孔后出現(xiàn)鰭皺，臀鰭開始發(fā)育。13日齡（圖1-E）仔魚全長3.48±0.05mm，胸鰭鰭條出現(xiàn)且在該日齡基本成形，背鰭則先后長出軟骨質(zhì)鰭條，尾鰭鰭條也在該階段逐漸增多，尾鰭骨骼發(fā)育基本完成；脊索上開始出現(xiàn)髓棘和脈棘。脊柱發(fā)育明顯提升了魚體的支撐和運(yùn)動(dòng)能力。

15日齡（圖1-F）仔魚全長4.30±0.05mm，其背鰭生長速度加快，胸鰭鰭條數(shù)增多，腹鰭原基出現(xiàn)并開始發(fā)育，背肋和腹肋以軟骨的形式生長，尾桿骨開始縮短，脊索末端持續(xù)上翹，尾鰭鰭條生長迅速；腹鰭鰭條開始生長，背肋和腹肋生長迅速，背鰭和胸鰭發(fā)育接近完全，其鰭條發(fā)育完整、清晰可見。19日齡（圖1-G）仔魚全長9.84±0.05mm，其腹鰭和臀鰭發(fā)育接近完全，鰭條清晰，胸鰭出現(xiàn)鰭棘，脊柱兩端出現(xiàn)明顯的分節(jié)和硬骨環(huán)，開始出現(xiàn)骨化現(xiàn)象，脊柱從兩端向中間開始骨化，尾鰭逐漸骨化，各附肢鰭條發(fā)育接近完整。背鰭、胸鰭、腹鰭和臀鰭發(fā)育接近完整，說明魚苗對(duì)平衡和方向控制能力的提升有利于提高其生存能力。

21日齡（圖1-H）仔魚全長10.96±0.05mm，其背肋和腹肋從脊柱基部向兩端的方向開始骨化，尾鰭骨化基本完成，髓弓、脈弓、髓棘和脈棘也開始骨化。23日齡（圖1-I）仔魚全長11.20±0.05mm，其胸鰭發(fā)育完全，鰭棘還在逐漸骨化，鰭條開始骨化并出現(xiàn)分節(jié)，胸鰭骨化程度存在差異，各附肢骨骼骨化接近完全，仔魚的骨骼發(fā)育基本完全，脊椎骨化接近完全，仔魚變態(tài)完成。骨骼發(fā)育的完成標(biāo)志著魚體形態(tài)已固定，至此以后魚苗的外形不會(huì)發(fā)生明顯變化，只有體色和大小的變化。

2.2尖吻鱸仔魚骨骼發(fā)育畸形現(xiàn)象

尖吻鱸仔魚脊柱骨骼畸形中最普遍的是椎體輕微畸形，表現(xiàn)為椎體側(cè)脊輕微變形。這種畸形僅發(fā)生于第16～24枚脊椎骨之間，每尾仔魚最多發(fā)生1～4枚的脊椎骨變形。脊柱畸形首次出現(xiàn)在10日齡（圖2-A）的尖吻鱸仔魚中，至22日齡時(shí)畸形率占樣本采集總量的8%，其中前期畸形的仔魚在14～15日齡時(shí)基本被淘汰。在20～22日齡的仔魚樣本中發(fā)現(xiàn)兩尾較嚴(yán)重的脊椎畸形個(gè)體，其脊椎骨、棘弓多處扭曲變形（圖2-B）或缺失（圖2-C）。高畸形率出現(xiàn)階段的確定，可為有針對(duì)性地降低畸形率提供準(zhǔn)確的時(shí)間節(jié)點(diǎn)。

3討論

至今，已有較多針對(duì)仔魚骨骼發(fā)育的相關(guān)研究報(bào)道。佟雪紅（2010）對(duì)大菱鲆（Scophthalmus maxi-mus）早期發(fā)育過程中骨骼畸形的發(fā)生進(jìn)行深入分析，陳淵戈等（2011）描述了刀鱭（Coilia nasus）仔魚早期脊柱和附肢骨骼發(fā)育的時(shí)序及特征；田文斐（2012）研究了鱖魚（Siniperca chuatsi）骨骼構(gòu)成與其攝食習(xí)性的關(guān)系。本研究結(jié)果表明，尖吻鱸仔魚的胸鰭在3日齡開始發(fā)育，背鰭在5日齡開始發(fā)育，腹鰭在15日齡開始發(fā)育，20日齡尾鰭發(fā)育完全。尖吻鱸仔魚骨骼的發(fā)育時(shí)序與前人的相關(guān)研究（Kohno eta1.，1996）相同，但發(fā)育的時(shí)間節(jié)點(diǎn)略有差異，其中，胸鰭和背鰭的發(fā)育時(shí)間較Kohno等（1996）報(bào)道的時(shí)間早，而腹鰭和尾鰭的發(fā)育時(shí)間較Kohno等（1996）報(bào)道的時(shí)間晚。究其原因可能與投喂餌料、自身的消化能力及生長環(huán)境的不同有關(guān)，也可能是地理隔離種群差異所造成（鄭珂等，2016）。

不同種類的魚脊椎骨骼結(jié)構(gòu)也有所不同，尖吻鱸的脊椎骨24枚、肋骨12對(duì)，而青石斑魚的脊柱由24枚脊椎骨構(gòu)成（王秋榮等，2012）、隆肛蛙（Ranaquadrana）蝌蚪具9塊脊椎骨（李翠萍，2013）。同科不同屬的魚脊椎骨骼也可能存在明顯差異，李仲輝和楊太有（2001）對(duì)大口黑鱸和尖吻鱸的骨骼系統(tǒng)進(jìn)行對(duì)比分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)大口黑鱸的脊椎骨有32枚，肋骨14～15對(duì)，與尖吻鱸的肋骨（12對(duì)）存在明顯差異，但二者的尾骨發(fā)育十分接近，均由5片尾下骨、1片尾上骨和1片尾桿骨構(gòu)成。李仲輝等（2012）研究還發(fā)現(xiàn)長尾大眼鯛（屬鱸形目）的脊椎骨20枚、肋骨7對(duì)，尾骨由5片尾下骨、1片尾上骨和1片尾桿骨構(gòu)成，與尖吻鱸的尾骨構(gòu)成相似，但脊椎骨和肋骨的數(shù)目存在明顯差異。不同的脊柱和附肢骨發(fā)育時(shí)序及脊椎骨數(shù)目，導(dǎo)致其體型、體長、體高等系列生物學(xué)特征存在著明顯區(qū)別，說明魚類早期的骨骼發(fā)育時(shí)序特征與骨骼結(jié)構(gòu)和數(shù)目密切相關(guān)。因此，通過魚類的骨骼發(fā)育和生長狀況掌握魚體的生理特征變化，可為魚類基因表達(dá)及性狀研究提供理論依據(jù)。

在尖吻鱸仔魚早期發(fā)育過程中，各鰭支鰭軟骨、脊柱、脊髓骨、背肋、腹肋等均會(huì)經(jīng)歷一個(gè)骨化過程。尖吻鱸附肢鰭骨的發(fā)育時(shí)序與其他魚類的差異不明顯，均表現(xiàn)為腹鰭發(fā)育略慢。由于尖吻鱸仔魚的髓弓和脈弓發(fā)育順序不同，對(duì)脊柱骨化也有明顯影響，髓弓從頸部向尾部發(fā)展，脈弓則是從體中部向兩邊的方向發(fā)展，脊柱是由兩端到中間的方向發(fā)生骨化，與日本鯤（Engraulis，aponicus）（Balart，1995）、緋小鯛（Pagellus erythrinus）（Sfakianakis et a1.，2004）等魚類的骨骼骨化順序一致，說明大部分魚類早期骨骼的骨化在生物發(fā)育和生物遺傳進(jìn)化上基本一致，不同種魚類在骨骼骨化發(fā)育發(fā)展上的進(jìn)程也基本一致。

本研究發(fā)現(xiàn)尖吻鱸仔魚在發(fā)育過程中，尤其是骨化過程中偶見畸形發(fā)生，早期的畸形個(gè)體在競(jìng)爭(zhēng)中會(huì)很快被淘汰，只有極少數(shù)能夠存活下來。早期尖吻鱸畸形發(fā)生會(huì)導(dǎo)致魚苗死亡，育苗存活率降低；而后期發(fā)生畸形會(huì)使魚苗生長緩慢，餌料系數(shù)低，魚體比例不協(xié)調(diào)，游泳速度變慢等，導(dǎo)致養(yǎng)殖成本增加。Fraser和de Nys（2005）研究表明，孵化后24～26日齡是尖吻鱸骨骼畸形突發(fā)率較高的時(shí)段；而本研究發(fā)現(xiàn)尖吻鱸仔魚脊柱骨骼畸形多發(fā)生在孵化后20-22日齡，其原因可能是：①與投喂的餌料種類、數(shù)量和質(zhì)量有關(guān)，②與育苗地區(qū)不同的溫度、餌料等生存環(huán)境有關(guān)；③與地理位置不同有關(guān)，即地域差異導(dǎo)致種內(nèi)差異。因此，準(zhǔn)確掌握不同魚類的骨骼發(fā)育規(guī)律有助于識(shí)別、分析畸形發(fā)生的時(shí)間及原因，有效防止畸形發(fā)生。

4結(jié)論

尖吻鱸仔魚脊柱及附肢骨的發(fā)育順序與其他魚類基本一致，但發(fā)育時(shí)間節(jié)點(diǎn)有所不同。尖吻鱸仔魚的骨骼發(fā)育畸形首次出現(xiàn)在10日齡左右，但主要集中在20-22日齡。

（責(zé)任編輯 蘭宗寶）