TP53在胃癌組織中的表達(dá)及臨床意義

周展新 尹曉華 謝黎明 葉東梅 肖玄 李娜 張志偉

[摘要]目的：選取課題組前期鑒定的胃癌相關(guān)蛋白質(zhì)TP53，了解該蛋白在胃腺癌組織中的表達(dá)情況，并分析其臨床意義。方法：采用胃癌組織芯片結(jié)合免疫組織化學(xué)染色分析TP53蛋白在胃癌組織中的表達(dá)。依據(jù)免疫組織化學(xué)染色檢測(cè)胃癌組織中的表達(dá)結(jié)果，結(jié)合患者的臨床資料，分析TP53蛋白表達(dá)與臨床資料兩者間的意義。結(jié)果：1、TP53蛋白主要表達(dá)于細(xì)胞核，其在不同組織中的表達(dá)率分別為正常胃粘膜2.82%、癌旁組織18.43%、胃癌62.39%、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移癌組織80.23%。胃癌組織中的陽(yáng)性表達(dá)率分別為高分化腺癌54.22%、中分化腺癌62.5%、低分化腺癌79.49%。2、胃腺癌與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移癌組織中TP53蛋白呈現(xiàn)高表達(dá)，且明顯較正常胃粘膜及癌旁組織中表達(dá)高（p<0.01）。癌旁與正常胃粘膜組織中TP53蛋白呈現(xiàn)低表達(dá)，但癌旁組織中表達(dá)較正常胃粘膜組織高（P<0.01）。3、胃腺癌組織分化程度的降低，TP53蛋白陽(yáng)性表達(dá)率逐漸增加（P<0.Ol）。TP53蛋白在胃腺癌組織中的表達(dá)與組織分化程度呈負(fù)相關(guān)，而與TNM分期及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移呈正相關(guān)（P[關(guān)鍵詞]胃癌；TP53蛋白；蛋白表達(dá)；臨床意義

胃癌（Gastric carcinoma，GC）是我國(guó)人群中發(fā)病率與死亡率為第二位的惡性腫瘤，居消化道腫瘤之首[1-3]。最近，我國(guó)胃癌的發(fā)生率逐年降低，仍是嚴(yán)重威脅人們健康與生命的常見惡性腫瘤[4，5]。因?yàn)槲赴┎课浑[蔽，早期癥狀不明顯，許多患者就診時(shí)已發(fā)展為晚期，臨床療效差，所以胃癌早期診斷對(duì)其防治顯得十分重要，提高其早期診斷依賴于新的技術(shù)發(fā)現(xiàn)。本研究選取課題組前期鑒定的胃癌相關(guān)蛋白質(zhì)TP53[6]，進(jìn)一步觀察其在胃癌組織中的表達(dá)情況與臨床意義，將為胃癌的診斷與鑒別，以及評(píng)估患者預(yù)后等提供相關(guān)的參考資料。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 臨床資料 收集2013年5月到2016年5月237例南華大學(xué)附屬第一醫(yī)院胃癌手術(shù)切除標(biāo)本，其中男性患者175例，女性患者62例；最大年齡者86歲，最小者27歲，平均年齡60歲；發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者169例，無(wú)轉(zhuǎn)移患者68例；依據(jù)2010年版WHO分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)，其中高分化腺癌者39例，中分化腺癌者113例，低分化腺癌者85例。按2009年版UICC/AJCC分期方案，其中I期33例，Ⅱ期55例，III135例，Ⅳ14例。另外，選取癌旁組織（距腫塊2cm以內(nèi)組織，為腸上皮化生，非典型性增生，粘膜慢性炎癥）237例，選取正常組織（距腫塊10厘米以上組織，可伴輕度炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，無(wú)腸上皮化生及非典型性增生）148例，選取轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)組織（淋巴結(jié)中見癌組織）88例?；颊咝g(shù)前均未接受過(guò)放化療，所有組織均經(jīng)病理確診組織學(xué)類型。

1.1.2 主要試劑 實(shí)驗(yàn)所用的TP53蛋白鼠抗與羊抗鼠二抗為Santa Cruz公司產(chǎn)品。S-P免疫組化與DAB檢測(cè)試劑盒購(gòu)自福建邁新生物技術(shù)有限公司。

1.2 方法

1.2.1 免疫組織化學(xué)染色 參考S-P免疫組化試劑盒說(shuō)明書步驟進(jìn)行操作，實(shí)驗(yàn)設(shè)立陽(yáng)性與陰性對(duì)照（陽(yáng)性對(duì)照由公司提供，陰性對(duì)照設(shè)置由PBS代替一抗體）。具體操作步驟如下：二甲苯進(jìn)行組織芯片充分脫蠟，PBS浸泡；經(jīng)梯度酒精水化，加熱抗原修復(fù)，PBS浸泡，過(guò)氧化物酶孵育，PBS浸泡，血清封閉，TP53蛋白一抗（1：500）4℃孵育過(guò)夜，PBS浸泡，二抗（1：1000） 37℃孵育15min.PBS浸泡，生物素蛋白一過(guò)氧化物酶抗體孵育，PBS浸泡，經(jīng)DAB孵育組織顯色，蘇木素細(xì)胞核復(fù)染，鹽酸乙醇分化，返藍(lán)、脫水、透明、封片，顯微鏡下觀察染色情況及陽(yáng)性反應(yīng)部位。

1.2.2 結(jié)果的判別 觀察組織芯片中染色情況，組織中蛋白表達(dá)顯色部位與陽(yáng)性表達(dá)細(xì)胞數(shù)。蛋白表達(dá)染色情況分為黃色、棕色及棕褐色。蛋白表達(dá)顯色部位為細(xì)胞核。觀察TP53蛋白表達(dá)的陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)，通過(guò)隨機(jī)選取每個(gè)芯片組織塊5個(gè)不同視野，對(duì)視野中表達(dá)陽(yáng)性細(xì)胞和所有細(xì)胞分別進(jìn)行計(jì)數(shù)，每個(gè)視野重復(fù)計(jì)數(shù)三次，取5個(gè)視野平均值代表相應(yīng)細(xì)胞數(shù)，計(jì)算蛋白在組織中的陽(yáng)性表達(dá)率。依據(jù)蛋白表達(dá)染色強(qiáng)度與陽(yáng)性表達(dá)率綜合分值分析，蛋白表達(dá)染色強(qiáng)度計(jì)分，其中1分表示無(wú)色，2分表示黃色，3分表示棕褐色；陽(yáng)性表達(dá)率計(jì)分，其中<10%計(jì)1分，11%-50%計(jì)2分；>50%計(jì)3分。綜合分值—蛋白質(zhì)染色強(qiáng)度計(jì)分×陽(yáng)性表達(dá)率計(jì)分，其中1分為陰性“一”，2-4分為陽(yáng)性“+”，>6分為強(qiáng)陽(yáng)性“+++”，另外，視野中陽(yáng)性細(xì)胞比例超過(guò)10%則表示為陽(yáng)性。

1.2.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 所有數(shù)據(jù)采用SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)分析軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，蛋白表達(dá)與不同臨床病理資料分析用x2檢驗(yàn)和方差分析，TP53蛋白表達(dá)的組間相關(guān)性分析用Spearman秩檢驗(yàn)進(jìn)行分析比較，以P<0.05表示資料分析差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 TP53蛋白在胃癌組織中的表達(dá)情況 免疫組織化學(xué)染色結(jié)果顯示，TP53蛋白表達(dá)于細(xì)胞核中，其在正常胃粘膜陽(yáng)性表達(dá)率為2.82%、癌旁組織為18.43%、胃腺癌為62.39%、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移癌為80.23%。胃腺癌與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移癌組織中TP53蛋白呈現(xiàn)高表達(dá)，且明顯較正常胃粘膜及癌旁組織中表達(dá)高（P<0.01）。癌旁與正常胃粘膜組織中TP53蛋白呈現(xiàn)低表達(dá)，但癌旁組織中表達(dá)較正常胃粘膜組織高（P<0.01）。TP53蛋白在高分化腺癌陽(yáng)性表達(dá)率為54.22%、中分化腺癌為62.5%、低分胃腺癌為79.49%，隨著胃腺癌分化程度的降低，TP53蛋白的陽(yáng)性表達(dá)率則逐漸升高，胃腺癌組織分化程度的降低，TP53蛋白陽(yáng)性表達(dá)率逐漸增加（P<0.01）。

2.2 TP53蛋白表達(dá)的臨床意義結(jié)合臨床病理資料結(jié)果分析，隨著胃癌的演進(jìn)TP53蛋白表達(dá)在組織中的變動(dòng)不斷升高，即在胃癌發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中TP53蛋白陽(yáng)性表達(dá)率逐漸增加。另外，TP53蛋白表達(dá)與患者年齡、性別、腫瘤大小均無(wú)關(guān)，其在胃腺癌組織中的表達(dá)與組織分化程度呈負(fù)相關(guān)，而與TNM分期及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移呈正相關(guān)（P<0.01）。

3 討論

目前，胃癌的發(fā)病機(jī)制研究及臨床療效方面取得了一定的成效，但早期診斷與治療仍是改善胃癌療效的重要舉措，早期診斷依賴于靈敏與特異性高的診斷技術(shù)發(fā)現(xiàn)。尋找胃癌診斷特異與敏感蛋白質(zhì)，對(duì)患者早期診斷與治療意義重大，也對(duì)胃癌的防治具有深遠(yuǎn)的臨床意義。經(jīng)大量的研究后，人們歸納腫瘤標(biāo)志物主要分為細(xì)胞表面相關(guān)標(biāo)志物、血清相關(guān)標(biāo)志物以及基因相關(guān)標(biāo)志物三大類[7]。為了獲取新的有價(jià)值的胃癌相關(guān)蛋白質(zhì)，課題組前期從正常胃粘膜、癌旁（非典型增生、腸上皮化生組織）、胃腺癌及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移癌組織中，篩選與鑒定了包括TP53蛋白在內(nèi)的243個(gè)胃癌相關(guān)蛋白質(zhì)，進(jìn)一步分析所獲相關(guān)蛋白質(zhì)在胃腺癌組織中的表達(dá)意義，生物學(xué)功能及表達(dá)與調(diào)節(jié)機(jī)制等可為挖掘胃癌發(fā)病的分子機(jī)制提供理論依據(jù)。因此，本研究通過(guò)組織芯片大樣本檢測(cè)相關(guān)蛋白質(zhì)的表達(dá)情況，分析其表達(dá)情況及臨床意義。

TP53是一種重要的抑瘤基因，該基因定位于染色體17p13.1區(qū)域，含有11個(gè)外顯子，編碼53kD的蛋白質(zhì)p53，其由393個(gè)氨基酸殘基組成[8]。p53蛋白是人體細(xì)胞中非常重要的核轉(zhuǎn)錄因子，被稱為“基因守護(hù)者”[7]。TP53在細(xì)胞內(nèi)主要通過(guò)監(jiān)測(cè)Gl和G2/M檢測(cè)點(diǎn)調(diào)節(jié)細(xì)胞周期，與其轉(zhuǎn)錄激活密切相關(guān)[10]。野生型p53蛋白含量低，半衰期短，容易水解，一般情況下無(wú)法檢測(cè)到。然而，突變型p53蛋白不易被水解，在細(xì)胞內(nèi)不斷積聚，容易檢測(cè)。突變型p53蛋白則喪失了原有蛋白的抑癌作用，并獲得了一系列癌基因的功能，如促進(jìn)細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化，加快細(xì)胞的生長(zhǎng)增殖，誘導(dǎo)細(xì)胞產(chǎn)生耐藥等。

許多研究發(fā)現(xiàn)，TP53基因在多種惡性腫瘤中發(fā)生基因突變，如肺癌、肝癌、結(jié)直腸癌等。目前，發(fā)現(xiàn)TP53基因的點(diǎn)突變至少有3500種，在腫瘤中的突變?nèi)Q于種類、性質(zhì)與位置，其點(diǎn)突變以錯(cuò)義突變?yōu)橹?，其突變位點(diǎn)主要包括175、248、249、273與282等氨基酸位點(diǎn)，產(chǎn)生突變體蛋白。有研究顯示，TP53在肺腺癌組織中突變率為63.3%，與腫塊大小和病理分期有關(guān)。TP53基因突變情況是判斷淋巴瘤和血液病預(yù)后的重要指標(biāo)之一，突變者預(yù)后差，容易復(fù)發(fā)與耐藥等[6]。本研究檢測(cè)為突變型TP53蛋白，其在胃癌及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移癌組織中呈現(xiàn)高表達(dá)，其表達(dá)與胃癌的分化程度、腫瘤的TNM分期及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移呈正相關(guān)，提示TP53基因在胃癌組織中喪失了抑瘤基因功能，扮演著促進(jìn)細(xì)胞增殖作用。與其他腫瘤檢測(cè)相似，檢測(cè)TP53表達(dá)有助于胃癌組織的鑒別。

總之，本文通過(guò)運(yùn)用胃癌組織芯片結(jié)合免疫組織化學(xué)染色分析了TP53蛋白在胃腺癌組織中的表達(dá)，以及與臨床病理資料間的關(guān)系，明確了檢測(cè)TP53蛋白表達(dá)有助于胃癌診斷的鑒別。證實(shí)了TP53蛋白在胃癌及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移癌組織中高表達(dá)與胃癌的發(fā)生和組織學(xué)類型有關(guān)。本文為獲取有價(jià)值的胃癌診斷相關(guān)蛋白質(zhì)提供了有利的實(shí)驗(yàn)資料與依據(jù)，也為深入挖掘胃癌發(fā)病的分子機(jī)制提供了新的思路。

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