黃綠苗辣椒生態(tài)型不育系的溫敏性分析及雜交種子純度鑒定

孫國勝 張昌偉 孫春青 戴忠良 馬志虎

摘要：【目的】分析黃綠苗辣椒生態(tài)型不育系YBM-EAB12的溫敏特性，為黃綠苗辣椒溫敏特異資源的開發(fā)利用提供參考依據(jù)?！痉椒ā繉⒗苯凡牧蟉BM-A2、YBM-EAB12、YBM-A2×C和YBM-EAB12×C分別進(jìn)行日溫/夜溫為20 ℃/15 ℃、25 ℃/20 ℃和30 ℃/25 ℃誘導(dǎo)后置于溫室種植管理，觀測各材料花粉的數(shù)量及萌發(fā)率，并進(jìn)行各親本育性和形態(tài)學(xué)鑒定及種子純度鑒定?！窘Y(jié)果】YBM-EAB12具有溫敏特性，育性轉(zhuǎn)化臨界溫度為22.5 ℃，在低溫（日均溫度低于22.5 ℃）條件下表現(xiàn)可育，可自交結(jié)實(shí)，日均溫度越低其可育程度越高，在高溫（日溫/夜溫為30 ℃/25 ℃）條件下表現(xiàn)完全不育。YBM-EAB12黃葉色性狀受1對隱性核基因控制。YBM-EAB12×C F2代群體分離結(jié)果表明，胞質(zhì)雄性不育與不育花器官特征緊密連鎖，YBM-EAB12×C F1代育性由單一核顯性基因恢復(fù)，不受低溫影響?！窘Y(jié)論】黃綠苗辣椒生態(tài)型不育系具有低溫可育特性，利用其進(jìn)行不育系繁種，可減少不育系與保持系雜交的步驟及辣椒不育系三系制種步驟，簡化繁制種子程序。

關(guān)鍵詞： 辣椒；黃綠苗；胞質(zhì)雄性不育（CMS）；溫敏

中圖分類號(hào)： S641.3 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號(hào)：2095-1191（2018）04-0735-06

Temperature sensibility analysis and hybrid seed purity identification of pepper yellow-green seedling mutant

ecotype sterile line

SUN Guo-sheng1， ZHANG Chang-wei2， SUN Chun-qing1， DAI Zhong-liang1， MA Zhi-hu1*

（1Zhenjiang Institute of Agricultural Sciences in Hilly Area of Jiangsu Province， Jurong， Jiangsu 212400， China； 2College of Horticulture， Nanjing Agricultural University， Nanjing 210095， China）

Abstract：【Objective】Temperature sensibility of yellow-green pepper mutant ecotype sterile line YBM-EAB12 were analyzed to provide reference for the resources exploitation and utilization of thermo-sensitive characters of yellow-green pepper. 【Method】The pepper materials YBM-A2， YBM-EAB12， YBM-A2×C and YBM-EAB12×C were respectively induced under the temperature conditions where day temperature/night temperature were 20 ℃/15 ℃， 25 ℃/20 ℃ and 30 ℃/25 ℃. Then the pepper materials were planted and managed in the greenhouse. The pollen quantities and pollen germination rates of pepper materials were observed； fertility of parents was researched. Morphological identification and seed purity identification were also conducted. 【Result】YBM-EAB12 enjoyed temperature sensibility. The critical tempe-rature of fertility transformation for YBM-EAB12 was 22.5 ℃. Under low temperature conditions（daily average temperature was below 22.5 ℃）， YBM-EAB12 was fertile and self-fertile. The lower daily average temperature，the higher fertility. But under high temperature conditions（day temperature/night temperature was 30 ℃/25 ℃）， YBM-EAB12 was completely sterile. The trait of yellow leaf were controlled by a pair of recessive nuclear gene. According to YBM-EAB12×C F2 population segregation results， cytoplasmic male sterility（CMS） was tightly linked to the organ characteristics of sterile flower. The fertility of YBM-EAB12×C F1 was restored by mononuclear dominant gene and was not affected by low temperature. 【Conclusion】Pepper yellow-green seedling ecotype sterile line has the characteristic of fertility under low temperature. Breeding the sterile line with pepper yellow-green seedling ecotype sterile line can reduce the step of hybridization between sterile line and maintainer line，reduce seed production step of third-line breeding in pepper sterility lines. It simplifies seed production procedure.

Key words：pepper； yellow-green seedling； cytoplasmic male sterrility（CMS）； temperature sensibility

0 引言

【研究意義】辣椒（Capsicum annuum L.）是世界范圍內(nèi)栽培最廣泛的馴化種（Wang and Bosland，2006），我國每年約栽培140萬ha。辣椒人工制種（通過人工去雄制種或雄性不育系制種）是目前我國乃至世界范圍內(nèi)的主要雜交制種手段（Berke，2000；Lee et al.，2010），其耗時(shí)長、工作量大、成本高，同時(shí)由于去雄不徹底存在雜種純度低等風(fēng)險(xiǎn)。雄性不育系的開發(fā)利用可提高雜交種子純度，降低人力工作量和制種成本（楊朝進(jìn)等，2008）。黃綠苗辣椒生態(tài)型不育系YBM-EAB12是以黃綠苗辣椒YBM與辣椒胞質(zhì)雄性不育系選育而成，具有葉色黃綠及雄性不育的特性，但在日均溫度低于22.5 ℃時(shí)轉(zhuǎn)變?yōu)榭捎?，或不育不完全，影響種子質(zhì)量。因此，分析黃綠苗辣椒生態(tài)型不育系的溫敏特性，對確定溫敏雄性不育辣椒材料育性轉(zhuǎn)化臨界溫度和轉(zhuǎn)化時(shí)期及溫敏辣椒資源和辣椒兩系法育種技術(shù)的推廣應(yīng)用具有重要意義?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】植物雄性不育主要分為細(xì)胞核雄性不育和胞質(zhì)雄性不育，已在水稻和辣椒雜交制種中廣泛應(yīng)用（鄒學(xué)校，2009）。與細(xì)胞核雄性不育相比，胞質(zhì)雄性不育無自花授粉機(jī)會(huì)，其后代100%不育，可省略田間去雜程序，極大降低雜交制種成本，確保種子純度（Dhaliwal and Jindal，2014）。楊仕華等（2009）研究認(rèn)為，我國水稻兩系法制種已大規(guī)模應(yīng)用于雜交水稻生產(chǎn)。馬志虎等（2001，2005）研究發(fā)現(xiàn)，將黃綠苗辣椒作為隱性核單基因黃葉色遺傳標(biāo)記應(yīng)用于F1代種子的純度鑒定耗時(shí)較短，可靠性極高，且利用黃綠苗辣椒材料已成功選育出辣椒品種鎮(zhèn)椒八號(hào)和黃綠苗辣椒胞質(zhì)雄性不育系。Ma等（2015）研究表明，黃綠苗辣椒YBM-12A株系在江蘇秋播時(shí)表現(xiàn)雄性可育或部分可育，低溫可誘導(dǎo)出>50%的可育株，在甘肅張掖和酒泉7～8月進(jìn)行雜交制種時(shí)，其育性表現(xiàn)十分徹底，F(xiàn)1代種子純度達(dá)100%；經(jīng)對YBM-12A多代定向選育，育成黃綠苗辣椒生態(tài)型雄性不育系。Ma等（2016）開展黃綠苗辣椒的黃化機(jī)理研究，通過對黃綠苗辣椒突變體進(jìn)行雄性不育轉(zhuǎn)育，育成了黃綠苗甜椒胞質(zhì)雄性不育系和葉用型黃葉辣椒胞質(zhì)雄性不育系?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】目前，針對黃綠苗辣椒突變體生態(tài)型不育系溫敏特性的研究鮮見報(bào)道。【擬解決的關(guān)鍵問題】分析黃綠苗辣椒生態(tài)型不育系及其F1代花粉育性的溫敏特性，觀測二者及其F2代分離群體花器官的形態(tài)，采用形態(tài)標(biāo)記法和生長試驗(yàn)（GoT）對不同區(qū)域繁制的F1代進(jìn)行純度鑒定，為黃綠苗辣椒溫敏特異資源開發(fā)辣椒兩系法（剔除保持系）育種方式提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1. 1 試驗(yàn)材料

黃綠苗辣椒胞質(zhì)雄性不育系YBM-A2（A）、生態(tài)型雄性不育系YBM-EAB12（AB）、恢復(fù)系tp12-36（C）、YBM-A2×C雜交一代（AC）、YBM-EAB12×C雜交一代（ABC）和YBM-A2×C雜交一代自交（AC）由江蘇丘陵地區(qū)鎮(zhèn)江農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所提供。

1. 2 試驗(yàn)方法

1. 2. 1 溫度誘導(dǎo) 于人工生長箱模擬自然溫度和光照日變化對YBM-A2、YBM-EAB12及其 F1代（YBM-A2×tp12-36和YBM-EAB12×tp12-36）進(jìn)行3個(gè)不同溫度處理，日溫/夜溫分別為20 ℃/15 ℃、25 ℃/20 ℃和30 ℃/25 ℃，白天光照為模擬自然光，夜晚為黑暗。每個(gè)溫度處理（A、AB及其F1代AC和ABC）均為20株。于幼苗期（8片真葉）開始進(jìn)行溫度誘導(dǎo)，10 d后置于溫室進(jìn)行生長狀況觀察。每處理3次重復(fù)。

1. 2. 2 花粉數(shù)量及萌發(fā)率測定 花粉數(shù)量參照葉正文等（2010）、Ma等（2013）的方法進(jìn)行測定，將100個(gè)未開裂的花藥放入10 mL離心管置于35 ℃烘箱中干燥，待花粉完全散出后加入1%六偏磷酸鈉溶液4 mL，定容至5 mL，在漩渦振蕩器上振蕩成懸浮液；用微量移液管吸取1 μL懸浮液滴于載玻片上，在倒置生物顯微鏡下觀察，統(tǒng)計(jì)花粉粒數(shù)量，重復(fù)5次，取每枚花藥花粉量（N）5次測定值的平均值，N=載玻片上的花粉總數(shù)×5000/100?；ǚ坳幐珊蟛ビ诠腆w培養(yǎng)基（0.01%硼酸+10%蔗糖+1%瓊脂）上，25 ℃暗培養(yǎng)（葉正文等，2010）6 h后統(tǒng)計(jì)花粉萌發(fā)率。 每處理隨機(jī)觀察6個(gè)視野，以花粉管長度大于花粉粒直徑視為萌發(fā)。

花粉萌發(fā)率（%）=已萌發(fā)花粉數(shù)/花粉總數(shù)×100

1. 2. 3 育性及形態(tài)學(xué)鑒定 在黃綠苗辣椒開花期，隨機(jī)選取生態(tài)型不育系及F1代（YBM-EAB12×tp12-36）的5朵花，參照Gulyas等（2006）的方法鑒定花粉育性，同時(shí)將F1代進(jìn)行自交獲得F2代，觀測、統(tǒng)計(jì)、分析其分離群體和花器官（雄蕊和花瓣）的形態(tài)。

1. 2. 4 種子純度測定 2013～2016年，分別在江蘇鎮(zhèn)江、云南元謀和甘肅張掖進(jìn)行雜交制種，組合分別為YBM-A2×tp12-36和YBM-EAB12×tp12-36，制種期日均氣溫22～28 ℃，共得到雜交種6份，胞質(zhì)雄性不育系不同區(qū)域雜交一代種子編號(hào)為AC-zj（鎮(zhèn)江）、AC-ym（元謀）和AC-zy（張掖）；生態(tài)型不育系不同區(qū)域雜交一代種子編號(hào)為ABC-zj（鎮(zhèn)江）、ABC-ym（元謀）和ABC-zy（張掖）。種子純度采用GoT和苗期形態(tài)標(biāo)記法進(jìn)行測定。每份雜交種隨機(jī)選取200粒飽滿種子，浸種后用透氣毛巾包好于28～30 ℃保濕催芽，期間每天用20～25 ℃溫水沖洗2次（時(shí)間分別為8：00和17：00）。待種子萌發(fā)后播于穴盤，置于溫度25～28 ℃、相對濕度45%～60%的標(biāo)準(zhǔn)溫室，每天給予16 h光照和8 h黑暗。幼苗子葉出土后3 d或具兩片真葉時(shí)進(jìn)行葉色遺傳標(biāo)記純度鑒定，F(xiàn)1代純度（%）=綠苗數(shù)/總苗數(shù)×100；苗期形態(tài)標(biāo)記經(jīng)純度鑒定后，待幼苗具8～11葉真葉時(shí)定植于大田進(jìn)行GoT，待掛果后依據(jù)果實(shí)及植株特征進(jìn)行純度測定，F(xiàn)1代純度（%）=符合F1代特征植株數(shù)/總株數(shù)×100。重復(fù)3次。

1. 3 統(tǒng)計(jì)分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用Excel 2006進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果與分析

2. 1 黃綠苗辣椒胞質(zhì)雄性不育系、生態(tài)型雄性不育系及其F1代的花粉數(shù)量和萌發(fā)率

由表1可知，YBM-A2和YBM-EAB12均在低溫條件下發(fā)生了育性轉(zhuǎn)變，育性變化與溫度存在直接關(guān)系；YBM-A2和YBM-EAB12的育性在22.5 ℃（育性變化溫度臨界點(diǎn)）發(fā)生逆轉(zhuǎn)，平均溫度越低其可育程度越高。其中，YBM-EAB12的可育花粉數(shù)量隨溫度的降低而迅速增加，可育花粉萌發(fā)率也隨之猛增，且二者的變幅遠(yuǎn)高于YBM-A2。YBM-EAB12×tp12-36的F1代平均可育花粉數(shù)量和可育花粉萌發(fā)率在不同溫度處理間均無明顯差異，說明其花粉育性不受低溫（15～25 ℃）或高溫（20～30 ℃）的影響。

2. 2 黃綠苗辣椒生態(tài)型不育系的形態(tài)學(xué)鑒定

由表2可知，在春季表現(xiàn)不育的YBM-EAB12花器較小，花藥窄小呈箭頭狀，無花粉?；蛴袠O少無活性花粉粒，花柱（4.8 mm）也短于可育花花柱（5.0 mm），柱頭略粗；花瓣長/寬為14.0 mm/7.5 mm，開張度≤60°，且均小于正?；?；花絲變短變細(xì)，顏色發(fā)白，花絲長3.0 mm，粗0.25～0.50 mm；蕾期花藥為紫色偏深，麥粒狀偏尖。在秋季表現(xiàn)可育的YBM-EAB12花瓣長/寬為15.0 mm/9.0 mm，開張角度近90°，花絲長4.2 mm，花絲粗0.50～0.70 mm，蕾期花藥顏色淡紫發(fā)黃，麥粒狀，雌蕊育性正常（圖1）。說明黃綠苗辣椒生態(tài)型不育系材料在春季和秋季冷涼條件下花器官的表現(xiàn)存在差異。

田間觀察發(fā)現(xiàn)，采用形態(tài)標(biāo)記法標(biāo)記的黃綠苗辣椒生態(tài)型不育系F1代（YBM-EAB12×tp12-36）新生和老葉葉色均為綠色，花器官可育。由表3可知，F(xiàn)2代群體分離結(jié)果為可育（花正常）∶不育（花皺縮）=3∶1[觀察發(fā)現(xiàn)不育株花器官均表現(xiàn)為雄蕊不育，無花粉，花瓣皺縮，開張度小，與可育株區(qū)別明顯（圖2）]；葉色分離結(jié)果為綠色∶黃色=3∶1。說明YBM-EAB12×tp12-36的F1代育性由1對核顯性恢復(fù)基因控制[χ2（0.028 df=3）<χ20.05，3=7.82]。

2. 3 種子純度鑒定結(jié)果

由表4可知，采用GoT的純度鑒定結(jié)果與苗期形態(tài)標(biāo)記純度鑒定結(jié)果高度一致，相關(guān)系數(shù)達(dá)0.98，說明苗期形態(tài)標(biāo)記純度鑒定的種子純度與GoT鑒定的種子純度呈高度線性正相關(guān)。由表4還可看出，YBM-A2×tp12-36的F1代種子純度在97.50%～99.67%，YBM-EAB12×tp12-36的F1代種子純度在99.67%～100.00%，YBM-EAB12×tp12-36的F1代純度略高。

假雜種（自交授粉/溫敏有粉）可在齊苗后正確鑒別，且純度鑒定結(jié)果也與GoT純度鑒定結(jié)果高度一致。苗期形態(tài)標(biāo)記純度鑒定所需時(shí)間為出苗后8～15 d（圖3），而GoT純度鑒定直至所有農(nóng)藝性狀全部表現(xiàn)出來才能進(jìn)行鑒定，所需時(shí)間為出苗后90～150 d，遠(yuǎn)長于苗期形態(tài)標(biāo)記純度鑒定。

3 討論

胞質(zhì)雄性不育是由不育系A(chǔ)（Srfrf）與保持系B（Nrfrf）雜交產(chǎn)生的后代，植株100%不育，對溫度敏感的胞質(zhì)雄性不育系統(tǒng)，A系可在低溫條件下自我保持，在高溫條件下表現(xiàn)不育，當(dāng)溫度低于22.5 ℃時(shí)，表現(xiàn)為可育，且平均溫度越低育性程度越高，其可育花粉數(shù)量和花粉萌發(fā)率隨溫度的降低而增加，可能與可育花粉數(shù)量和花粉萌發(fā)集團(tuán)效應(yīng)有關(guān)（Dhaliwal and Jindal，2014）。本研究結(jié)果表明，在低溫條件下，黃綠苗辣椒胞質(zhì)雄性不育系YBM-EAB12的育性很容易受到誘導(dǎo)，且存在株系間差異，與已有的研究報(bào)道（Shifriss，1997）一致。在水稻（曾漢來等，1996）中發(fā)現(xiàn)的溫敏型不育系育性轉(zhuǎn)變溫度為26.0 ℃，高于26.0 ℃表現(xiàn)為可育，低于此溫度表現(xiàn)為不育，本研究結(jié)果與其相似。

本研究中，黃綠苗辣椒生態(tài)型不育系材料春季不育花器官的形態(tài)與秋季可育花器官表現(xiàn)不同，同一植株上春季花的形態(tài)表現(xiàn)為不育材料形態(tài)，典型性狀為花藥窄尖、花瓣皺縮，花瓣開張度≤60°，而秋季的典型性狀為花藥較飽滿，花瓣平展，花瓣開張度近90°，可判斷黃綠苗辣椒生態(tài)型不育基因與花器官的形態(tài)緊密連鎖；將黃綠苗辣椒形態(tài)標(biāo)記與生態(tài)不育相結(jié)合，可減少雜交種子純度鑒定時(shí)間，且苗期形態(tài)純度鑒定與GoT純度鑒定結(jié)果高度一致。形態(tài)標(biāo)記以其直觀、可信度高為商業(yè)化種子生產(chǎn)所接受，如在番茄和馬鈴薯中發(fā)現(xiàn)的花青素缺失突變體和葉色突變體已得到利用（Georgiev，1991），Ilbi（2003）的研究也表明，苗期形態(tài)標(biāo)記可用于檢測雜交種子純度，無需進(jìn)行GoT鑒定。

唐文邦等（2011）研究發(fā)現(xiàn)，黃綠苗辣椒生態(tài)型不育系對育性轉(zhuǎn)換溫度敏感，不易產(chǎn)生育性漂變而影響制種安全。本研究觀察發(fā)現(xiàn)，黃綠苗辣椒生態(tài)型不育系YBM-EAB12在甘肅酒泉和張掖夏播時(shí)表現(xiàn)雄性不育，制種時(shí)期日均溫度在22.5 ℃以上，日均最低溫度大于14.0 ℃，日均最高溫度28.0 ℃，其不育花器官的形態(tài)特征表現(xiàn)與原不育系相同，而鏡檢及雜交F1代純度檢測結(jié)果表明其不育性十分徹底，說明用生態(tài)型不育系配制的辣椒組合育性不受溫度影響，可很好地展現(xiàn)黃綠苗辣椒生態(tài)型不育系的特點(diǎn)，且黃綠苗辣椒生態(tài)型不育系與恢復(fù)系的異交結(jié)實(shí)率高，無水稻兩系法制種過程中產(chǎn)量較低、制種成本高的缺點(diǎn)（斯華敏等，2011），可用于低成本生產(chǎn)辣椒雜交種子。

4 結(jié)論

黃綠苗辣椒生態(tài)型不育系通過生態(tài)區(qū)溫度變化將自身變?yōu)楸３窒?，簡化了制種過程，是對傳統(tǒng)辣椒育種技術(shù)的一次革新；將辣椒苗期黃綠葉色標(biāo)記為苗期形態(tài)鑒定性狀，可簡化種子純度鑒定程序。

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（責(zé)任編輯 思利華）