RP—HPLC法同時(shí)測定新疆紫草中紫草素、乙酰紫草素、β β—二甲基丙烯酰紫草素的含量

孫健文 溫憲春 蔡德富 王玥 吳永會

中圖分類號 R284.1；R917 文獻(xiàn)標(biāo)志碼 A 文章編號 1001-0408（2018）04-0455-03

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2018.04.06

摘 要 目的：建立同時(shí)測定新疆紫草中紫草素、乙酰紫草素、β，β-二甲基丙烯酰紫草素含量的方法。方法：采用反相高效液相色譜法，色譜柱為Kromasil 100-5 C18，流動相為乙腈-0.1%甲酸溶液（80 ∶ 20，V/V），流速為1.0 mL/min，檢測波長為516 nm，柱溫為25 ℃，進(jìn)樣量為10 μL。結(jié)果：紫草素、乙酰紫草素、β，β-二甲基丙烯酰紫草素檢測質(zhì)量濃度線性范圍分別為0.404～10.100 μg/mL（r=0.999 8）、5.350～107.000 μg/mL（r=0.999 6）、2.035～40.700 μg/mL（r=0.999 8）；定量限分別為0.40、2.91、1.34 μg/mL，檢測限分別為0.12、0.87、0.40 μg/mL；精密度、穩(wěn)定性、重復(fù)性試驗(yàn)的RSD<2.0%（n=6）；加樣回收率分別為99.12%～104.18%（RSD=1.85%，n=6）、96.51%～100.21%（RSD=1.43%，n=6）、98.11%～102.51%（RSD=1.42%，n=6）。結(jié)論：該方法操作簡便，精密度、穩(wěn)定性、重復(fù)性好，可用于新疆紫草中紫草素、乙酰紫草素、β，β-二甲基丙烯酰紫草素含量的同時(shí)測定。

關(guān)鍵詞 紫草；紫草素；乙酰紫草素；β，β-二甲基丙烯酰紫草素；反相高效液相色譜法；含量

ABSTRACT OBJECTIVE： To establish a method for the simultaneous determination of shikonin， acetylshikonin and β，β-dimethylacrylshikonin in Arnebia euchroma. METHODS： RP-HPLC method was adopted. The determination was performed on Kromasil 100-5 C18 column with mobile phase consisted of acetonitrile-0.1% formic acid solution（80 ∶ 20，V/V） at the flow rate of 1.0 mL/min. The detection wavelength was set at 516 nm， column temperature was 25 ℃， and sample size was 10 μL. RESULTS： The linear ranges of shikonin， acetylshikonin and β，β-dimethylacrylshikonin were 0.404-10.100 μg/mL（r=0.999 8）， 5.350-107.000 μg/mL（r=0.999 6）， 2.035-40.700 μg/mL（r=0.999 8）， respectively. The limit of quantitation was 0.40，2.91，1.34 μg/mL， and the limit of detection was 0.12，0.87，0.40 μg/mL. RSDs of precision， stability and reproducibility tests were all lower than 2.0% （n=6）. The recovery rate were 99.12%-104.18%（RSD=1.85%，n=6），96.51%-100.21%（RSD=1.43%，n=6）， 98.11%-102.51% （RSD=1.42%，n=6）， respectively. CONCLUSIONS： The method is simple， precise， stable and reproducible. It can be used for simultaneous determination of shikonin， acetylshikonin and β，β-dimethylacrylshikonin in A. euchroma.

KEYWORDS Arnebia euchroma； Shikonin； Acetylshikonin； β，β-dimethylacrylshikonin； RP-HPLC；Content

紫草（Arnebia euchroma）為我國傳統(tǒng)常見中藥，也是新疆特色藥材[1]，其作為藥用最初載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，列為中品，多用于麻疹不透、濕疹、水火燙傷等癥[2]，臨床上常用于治療靜脈炎、燒燙傷、皮膚病和慢性腎炎等[3]。現(xiàn)代研究表明，紫草藥材中的主要活性成分為羥基萘醌色素類成分，其中的紫草素及其衍生物具有抗癌、抗炎、降血糖、提高免疫力等多種作用[4-5]。紫草藥材不僅被廣泛應(yīng)用于臨床，同時(shí)在食品、化妝品、印染工業(yè)中也得到廣泛應(yīng)用[6]。

目前，治療癌癥的主要措施仍為化療，但化療的副作用較大，嚴(yán)重影響患者的生存質(zhì)量。因此，尋找高效、副作用小的治療方法刻不容緩[7]。紫草藥材由于其具有良好的抗癌作用，且作用機(jī)制涉及多個(gè)靶點(diǎn)[8-10]，廣受關(guān)注。2015年版《中國藥典》（一部）僅以紫草素、β，β-二甲基丙烯酰紫草素為指標(biāo)成分進(jìn)行紫草藥材及飲片的質(zhì)量控制，缺乏質(zhì)量評價(jià)的科學(xué)性和全面性[11-12]。

本試驗(yàn)采用反相高效液相色譜法（RP-HPLC）對紫草藥材中3種萘醌類成分紫草素、乙酰紫草素、β，β-二甲基丙烯酰紫草素的含量進(jìn)行了同時(shí)測定，旨在建立一種簡單、快速的紫草藥材中多種色素成分的定量方法，以期為其質(zhì)量控制提供快速、有效的檢測方法。

1 材料

1.1 儀器

600 Controller型HPLC儀，包括2487型紫外檢測器、Empower 3色譜數(shù)據(jù)軟件（美國Waters公司）； KQ-50DE型數(shù)控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；AE240型電子分析天平（瑞士Mettler Toledo公司）。

1.2 試劑

紫草素對照品（批號：B21682，純度：≥98.0%）、乙酰紫草素對照品（批號：B21508，純度：≥98.0%）、β，β-二甲基丙烯酰紫草素對照品（批號：B24012， 純度：≥98.0%）均購自上海源葉生物科技有限公司；乙腈為色譜純，甲酸為分析純；水為去離子水。

1.3 藥材

紫草藥材購于新疆當(dāng)?shù)厮幍辏ㄅ枺?0100310、20140801、20161001），經(jīng)齊齊哈爾醫(yī)學(xué)院郭麗娜教授鑒定為真品。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱：Kromasil 100-5 C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相：乙腈-0.1%甲酸溶液（80 ∶ 20，V/V）；流速：1.0 mL/min；檢測波長：516 nm；柱溫：25 ℃；進(jìn)樣量：10 μL。

2.2 溶液的制備

2.2.1 混合對照品溶液 精密稱取待測成分對照品各適量，分別置于10 mL量瓶中，加甲醇溶解并定容，搖勻，得單一對照品貯備液；精密量取上述單一對照品貯備液各適量，加甲醇制成紫草素、乙醇紫草素、β，β-二甲基丙烯酰紫草素質(zhì)量濃度分別為4.04、42.80、32.56 μg/mL的混合對照品溶液。

2.2.2 供試品溶液 精密稱取藥材樣品粉末（過2號篩）0.2 g，置于10 mL量瓶中，加甲醇定容，超聲（功率：150 W，頻率：40 kHz）提取45 min，室溫下放置，加甲醇定容，搖勻，經(jīng)0.45 μm微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液1 mL，加甲醇定容至5 mL，即得。

2.2.3 陰性對照溶液 以甲醇作為陰性對照溶液。

2.3 系統(tǒng)適用性試驗(yàn)

取“2.2”項(xiàng)下混合對照品溶液、供試品溶液、陰性對照溶液各適量，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定。結(jié)果表明，理論板數(shù)以紫草素、乙酰紫草素、β，β-二甲基丙烯酰紫草素峰計(jì)均>8 000；分離度>1.5，各成分基線分離良好，詳見圖1。

2.4 線性關(guān)系考察

分別精密量取“2.2.1”項(xiàng)下單一對照品貯備液各適量，分別置于10 mL量瓶中，加流動相定容，制成紫草素質(zhì)量濃度為0.404、0.808、1.616、3.232、10.100 μg/mL，乙酰紫草素質(zhì)量濃度為5.350、10.700、17.120、21.400、107.000 μg/mL，β，β-二甲基丙烯酰紫草素質(zhì)量濃度為2.035、4.070、8.140、16.280、40.700 μg/mL的系列單一對照品溶液。精密量取上述系列單一對照品溶液各10 μL，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定，記錄峰面積。以紫草素、乙酰紫草素、β，β-二甲基丙烯酰紫草素質(zhì)量濃度（x，μg/mL）為橫坐標(biāo)、峰面積（y）為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸?；貧w方程與線性范圍見表1。

2.5 定量限與檢測限考察

取“2.2.1”項(xiàng)下單一對照品貯備液各適量，倍比稀釋，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣測定6次，記錄峰面積。當(dāng)信噪比為10 ∶ 1時(shí)，得定量限；當(dāng)信噪比為3 ∶ 1時(shí)，得檢測限。結(jié)果，紫草素、乙酰紫草素、β，β-二甲基丙烯酰紫草素的定量限分別為0.40、2.91、1.34 μg/mL，檢測限分別為0.12、0.87、0.40 μg/mL。

2.6 精密度試驗(yàn)

取“2.2.1”項(xiàng)下單一對照品貯備液各適量，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣測定6次，記錄峰面積。結(jié)果，紫草素、乙酰紫草素、β，β-二甲基丙烯酰紫草素峰面積的RSD分別為0.96%、1.31%、0.64% （n=6），表明儀器精密度良好。

2.7 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取“2.2.2”項(xiàng)下供試品溶液（批號：50100310）適量，分別于室溫下放置0、4、8、12、24、48 h時(shí)按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定，記錄峰面積。結(jié)果，紫草素、乙酰紫草素、β，β-二甲基丙烯酰紫草素峰面積的RSD分別為0.59%、0.81%、0.72%（n=6），表明供試品溶液室溫放置48 h內(nèi)基本穩(wěn)定。

2.8 重復(fù)性試驗(yàn)

精密稱取藥材樣品（批號：50100310）適量，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，共6份，再按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定，記錄峰面積并計(jì)算藥材樣品含量。結(jié)果，紫草素、乙酰紫草素、β，β-二甲基丙烯酰紫草素含量平均值分別為0.456、8.587、5.175 mg/g，RSD分別為1.42%、0.38%、0.74%（n=6），表明本方法重復(fù)性良好。

2.9 加樣回收率試驗(yàn)

取已知含量藥材樣品（批號：50100310）6份，每份0.1 g，分別加入一定量的待測成分對照品溶液，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，再按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定，記錄峰面積并計(jì)算加樣回收率，結(jié)果見表2。

2.10 藥材樣品含量測定

取3批藥材樣品各適量，分別按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液各3份，再按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定，記錄峰面積并計(jì)算樣品含量，結(jié)果見表3。

3 討論

目前，新疆紫草還不能有效地進(jìn)行人工種植，但國內(nèi)乃至國際市場需求量卻在日益增加，野生新疆紫草遭到掠奪性采摘，因此有效合理地利用紫草藥材中的有效成分非常重要；同時(shí)，研究紫草藥材中有效成分的相關(guān)作用也成為熱點(diǎn)課題[2]。

預(yù)試驗(yàn)考察流動相時(shí)，筆者曾嘗試乙腈-水（75 ∶ 25，V/V），結(jié)果發(fā)現(xiàn)待測成分峰峰形不好，后改用乙腈-0.1%甲酸溶液（80 ∶ 20，V/V），結(jié)果待測成分峰峰形良好，且保留時(shí)間穩(wěn)定。因此，最終將流動相確定為后者。根據(jù)2015年版《中國藥典》（一部），紫草藥材中總萘醌吸收波長為516 nm[12]，故本研究以此作檢測波長。

由含量測定結(jié)果可知，3批藥材樣品中乙酰紫草素、β，β-二甲基丙烯酰紫草素含量變化較大，其原因可能為紫草藥材尚不能人工種植，而野生品種的生長區(qū)域、產(chǎn)收時(shí)間不同導(dǎo)致其成分含量變化大[3]。各批次紫草藥材中乙酰紫草素含量均為最高，說明紫草萘醌色素類化合物中乙酰紫草素為主要成分，該論據(jù)為本課題組進(jìn)一步研究乙酰紫草素抗腫瘤作用提供了幫助。

綜上所述，本方法操作簡便，精密度、穩(wěn)定性、重復(fù)性好，可用于新疆紫草中紫草素、乙酰紫草素、β，β-二甲基丙烯酰紫草素含量的同時(shí)測定。

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（收稿日期：2017-04-20 修回日期：2017-06-06）

（編輯：張 靜）