發(fā)酵蟲(chóng)草菌粉多糖免疫活性實(shí)驗(yàn)研究

蔣洪亮　趙修南　麻浩

摘要目的：探究發(fā)酵蟲(chóng)草菌粉多糖的免疫活性。方法：發(fā)酵蟲(chóng)草菌粉通過(guò)水提醇沉、復(fù)溶、透析、濃縮、冷凍干燥得多糖，命名為CSMP60，其提取條件：60 ℃水提、提取時(shí)間4 h、料液比1∶15、提取次數(shù)2次。以小鼠免疫細(xì)胞為材料，檢測(cè)CSMP60的免疫活性。結(jié)果：CSMP60能促進(jìn)脾細(xì)胞的增殖（P<005），明顯促進(jìn)小鼠腹腔巨噬細(xì)胞分泌TNFα（P<005），有促進(jìn)脾淋巴細(xì)胞分泌IFNγ的趨勢(shì)。結(jié)論：CSMP60可能是發(fā)酵蟲(chóng)草菌粉產(chǎn)生免疫活性的效應(yīng)物質(zhì)之一。

關(guān)鍵詞發(fā)酵蟲(chóng)草菌粉；多糖；細(xì)胞增殖；脾細(xì)胞；巨噬細(xì)胞；免疫活性；腫瘤壞死因子；γ干擾素

Experimental Study on Immune Activities of Polysaccharides from Fermented Cordycepssinensis Powders

Jiang Hongliang1，Zhao Xiunan2，Ma Hao2，He Lifang3，Shan Junjie2，Wang Hainan1，4

（1 School of Pharmaceutical Sciences，Guizhou University，Guiyang 550025，China； 2 Institute of Military Medicine，Academy of Military Sciences，Beijing 100850，China； 3 Hunan University of Chinese Medicine，Changsha 410208，China； 4 China Food and Drug Administration，Beijing 100053，China）

AbstractObjective：To investigate the immunological activity of polysaccharides from fermented Cordycepssinensis powders.Methods：Polysaccharides from fermented Cordycepssinensis powders were obtained through water extraction and alcohol precipitation，reconstitution，dialysis，concentration and freezedrying，named after CSMP60.Its extraction conditions：60 ℃ water extraction，extraction time 4h，solidliquid ratio 1∶15，the number of extractions 2 times.The immune activity of CSMP60 was measured using mouse immune cells.Results：CSMP60 could promote the proliferation of spleen cells （P<005），and significantly promote the secretion of TNFα from mouse peritoneal macrophages （P<005）.It has a tendency to promote the secretion of IFNγ by spleen cells.Conclusion：CSMP60 may be one of the immunocompetence substances of fermented Cordycepssinensis powders.

Key WordsFermented Cordycepssinensis powders； Polysaccharides； Cell proliferation； Spleen cells； Macrophages； Immune activity； TNFα； IFNγ

中圖分類號(hào)：R2855文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：Adoi：10.3969/j.issn.1673-7202.2018.08.050

發(fā)酵蟲(chóng)草菌粉是我國(guó)學(xué)者運(yùn)用冬蟲(chóng)夏草無(wú)性型深層發(fā)酵技術(shù)研究獲得的發(fā)酵蟲(chóng)草菌絲產(chǎn)品，于上世紀(jì)80年代被批準(zhǔn)作為中藥材用于臨床[1]。已往大量研究發(fā)現(xiàn)，發(fā)酵蟲(chóng)草菌粉具有抗腫瘤、抗氧化、免疫調(diào)節(jié)、保護(hù)肝和腎等藥理作用。為進(jìn)一步研究發(fā)酵蟲(chóng)草菌粉發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用的物質(zhì)基礎(chǔ)，從發(fā)酵蟲(chóng)草菌粉中水提獲得多糖（CSMP60），并探究不同濃度CSMP60對(duì)脾細(xì)胞增殖、脾細(xì)胞分泌FINγ和巨噬細(xì)胞分泌TNFα的影響。

1材料與方法

11材料

111動(dòng)物Balb/C小鼠（雌性，6～8周齡）：軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，合格證號(hào)為軍科院SCXK（軍）2012001。飼養(yǎng)條件：溫度22～26 ℃，濕度40%～60%，標(biāo)準(zhǔn)飼料喂養(yǎng)，自由飲水。

112藥物發(fā)酵蟲(chóng)草菌粉，產(chǎn)地：江西國(guó)藥，國(guó)藥準(zhǔn)字Z10890021。

發(fā)酵蟲(chóng)草菌粉多糖的制備：稱取發(fā)酵蟲(chóng)草菌粉1 kg，向其中加入15 L去離子水，60 ℃條件下水浴浸提4 h，期間不時(shí)攪拌，然后用2層紗布濾過(guò)，濾過(guò)后的殘?jiān)谕瑯訔l件下進(jìn)行第2次提取。合并兩次提取的濾液，濾液在3 000 r/min、10 min條件下離心，離心后上清液于50～55 ℃減壓濃縮獲得水提濃縮液（濃縮約為1 L）。緩緩加入濃縮液3倍體積的95%乙醇，邊加邊攪拌，室溫下靜置醇沉72 h?；旌象w系在3 000 r/min、10 min條件下離心，分離沉淀部分，向沉淀部分中加入去離子水?dāng)嚢枞芙?，離心（3 000 r/min、10 min），再將沉淀同樣操作3次。合并離心后的上清液，裝入透析袋，用自來(lái)水透析72 h（一邊透析一邊搖晃），去除小分子雜質(zhì)。將袋內(nèi)透析液離心，上清液減壓濃縮后，進(jìn)行冷凍干燥，得到發(fā)酵蟲(chóng)草菌粉多糖（CSMP60）[25]。1 kg發(fā)酵蟲(chóng)草菌粉經(jīng)水提醇沉、復(fù)溶、透析、濃縮、冷凍干燥得6653 g黃色粉末，得率為665%。

113試劑與儀器乙醇：分析純，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。刀豆球蛋白（Concanavalin A，ConA）和脂多糖（Lipopolysaccharides，LPS）：美國(guó)Sigma公司。RPMI 1640培養(yǎng)基：美國(guó)Hyclone公司。MTT：Amresco公司。DMEM培養(yǎng)液：Gibco公司。胎牛血清（FBS）：浙江天杭生物科技有限公司。胰蛋白酶：Amresco公司。十二烷基硫酸鈉（SDS）：Amresco公司。其余試劑：分析純，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。紅細(xì)胞裂解液（TrisNH4Cl緩沖液）：017 mol/L Tris與016 mol/L NH4Cl按1∶9混合，調(diào)pH為72，經(jīng)022 μm濾膜濾過(guò)除菌，4 ℃存放。ELISA試劑盒：購(gòu)自欣博盛生物科技有限公司。DLI15型臺(tái)式封閉電爐：天津市泰斯特儀器有限公司。旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀：上海亞榮生化儀器廠。分析天平：Ohaus公司。LGJ25 C冷凍干燥機(jī)：北京四環(huán)凍干機(jī)廠。DZF6020真空干燥箱：上海一恒科技有限公司。YTCJ2ND超凈工作臺(tái)：北京亞泰公司。DHP9161型電熱恒溫培養(yǎng)箱：上海一恒科學(xué)儀器有限公司。流式細(xì)胞儀：FACS caliber，美國(guó)BD公司。MCO15AC型CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱：日本三洋。CKX41型生物顯微鏡：日本OLYMPUS公司。YX280D型高壓蒸汽消毒器：江蘇江陰濱江醫(yī)療設(shè)備有限公司。96孔ELISA板：美國(guó)Costar公司。CF16RXⅡ型冷凍離心機(jī)：日本HITACHI公司。Varioskau Flash version 243酶標(biāo)儀和F101620型洗板機(jī)：美國(guó)Thermo Scientific公司。

12方法

121分組與模型制備

1211分組分正常組、對(duì)照組（ConA組或LPS組）、給藥組（低劑量組、中劑量組、高劑量組）。

1212小鼠原代脾細(xì)胞懸液的制備放血處死Bald/C小鼠，在超凈臺(tái)無(wú)菌條件下將取出的脾臟放在置于盛有10 mL RPMI 1640培養(yǎng)基的滅菌玻璃培養(yǎng)皿中的100目尼龍網(wǎng)篩上，然后用消毒的玻璃注射器針芯研磨脾臟，使其細(xì)胞濾過(guò)網(wǎng)篩，制成脾細(xì)胞懸液。以1 000 r/min離心脾細(xì)胞懸液10 min，棄上清，加入2 mL TrisNH4Cl緩沖液作用3～5 min，再加3 mL培養(yǎng)基同上離心洗滌2次，再次重懸細(xì)胞，用含20%FBS的RPMI 1640培養(yǎng)基調(diào)整細(xì)胞密度為5×109/L。

1213小鼠腹腔巨噬細(xì)胞懸液的制備處死小鼠，在超凈臺(tái)無(wú)菌條件下腹腔注射含5%FBS的RPMI 1640培養(yǎng)液，然后抽取腹腔溶液，離心10 min（600×g），棄上清，加入紅細(xì)胞溶脹液后，用細(xì)胞培養(yǎng)液洗滌3次。用含10%FBS的RPMI 1640培養(yǎng)液重懸細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞密度為25×108/L。

122給藥方法

將CSMP60溶解于細(xì)胞培養(yǎng)液中，配制成各種所需濃度的藥物溶液添加于孔板中。

123檢測(cè)指標(biāo)與方法

1231MTT法測(cè)定CSMP60對(duì)小鼠原代脾細(xì)胞增殖的影響將上述調(diào)整細(xì)胞密度后的脾細(xì)胞懸液加入無(wú)菌96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，100 μL/孔。正常對(duì)照孔只加等體積的RPMI 1640培養(yǎng)液，其余各孔再分別加入100 μL不同濃度CSMP60（終濃度分別為10、50和250 mg/L）、ConA（終濃度2 mg/L）、LPS（終濃度15 mg/L）。每組設(shè)3復(fù)孔。將培養(yǎng)板置于5% CO2培養(yǎng)箱37 ℃孵育48 h。取出培養(yǎng)板，無(wú)菌條件下每孔取出100 μL上清棄去，加入5 g/L的MTT溶液20 μL，將培養(yǎng)板置于5% CO2培養(yǎng)箱37 ℃孵育4 h。取出培養(yǎng)板，在每孔中加DMSO 150 μL，用酶標(biāo)儀檢測(cè)570 nm吸光度（A570），計(jì)算細(xì)胞增殖百分率[68]。

1232MTT法測(cè)定CSMP60協(xié)同絲裂原對(duì)小鼠原代脾淋巴細(xì)胞增殖的影響將上述調(diào)整細(xì)胞密度后的脾細(xì)胞懸液加入無(wú)菌96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中。設(shè)正常對(duì)照、ConA（終濃度2 mg/L）或LPS（終濃度15 mg/L）對(duì)照。正常對(duì)照孔只加RPMI 1640培養(yǎng)液，絲裂原對(duì)照孔加入ConA（終濃度2 mg/L）或LPS（終濃度15 mg/L）。其余各孔加入CSMP60（終濃度分別為10、50和250 mg/L），同時(shí)加入ConA（終濃度2 mg/L）或LPS（終濃度15 mg/L）。每組設(shè)3復(fù)孔。將培養(yǎng)板置于5% CO2培養(yǎng)箱37 ℃孵育48 h。取出培養(yǎng)板，無(wú)菌條件下每孔取出100 μL上清棄去，加入5 g/L的MTT溶液20 μL，將培養(yǎng)板置于5%CO2培養(yǎng)箱37 ℃孵育4 h。取出培養(yǎng)板，在每孔中加DMSO 150 μL，用酶標(biāo)儀檢測(cè)570 nm吸光度（A570），計(jì)算細(xì)胞增殖百分率。

1233測(cè)定CSMP60對(duì)小鼠腹腔巨噬細(xì)胞分泌TNFα的影響將上述調(diào)整細(xì)胞密度后的巨噬細(xì)胞懸液加入24孔培養(yǎng)板，05 mL/孔，置于5% CO2培養(yǎng)箱37 ℃孵育2 h。吸去上清，用09% NaCl去除未貼附的細(xì)胞，然后每孔分別加入1 mL細(xì)胞培養(yǎng)液、LPS（終濃度15 mg/L）及CSMP60（終濃度分別為10、50和250 mg/L）。每組設(shè)3復(fù)孔，然后置于5% CO2培養(yǎng)箱37 ℃孵育48 h。離心，收集培養(yǎng)液上清，采用ELISA試劑盒測(cè)定細(xì)胞上清液中的TNFα含量[9]。

1234測(cè)定CSMP60對(duì)小鼠脾淋巴細(xì)胞分泌IFNγ的影響將上述調(diào)整細(xì)胞密度后的脾細(xì)胞懸液加入24孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，每孔各加入05 mL。再加入05 mL CSMP60溶液，終濃度分別為10、50、250 mg/L。另設(shè)ConA（2 mg/L）和正常對(duì)照。每組設(shè)3復(fù)孔。然后將培養(yǎng)板置于5% CO2培養(yǎng)箱37 ℃孵育72 h，取出細(xì)胞培養(yǎng)液，離心10 min （600×g），收集上清液，按照ELISA試劑盒說(shuō)明書(shū)測(cè)定脾細(xì)胞培養(yǎng)上清IFNγ含量[10]。按照ELISA試劑盒說(shuō)明書(shū)測(cè)定脾細(xì)胞培養(yǎng)上清IFNγ含量[10]。

13統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS 130統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，實(shí)驗(yàn)結(jié)果數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，進(jìn)行oneway ANOVA方差分析。以P<005為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2結(jié)果

21CSMP60對(duì)小鼠原代脾細(xì)胞增殖的影響結(jié)果表明，在無(wú)絲裂原刺激的情況下，CSMF60能促進(jìn)小鼠原代脾細(xì)胞的增殖，且呈現(xiàn)量效關(guān)系。中劑量CSMF60能協(xié)同LPS促進(jìn)小鼠原代脾淋巴細(xì)胞增殖（P<005），CSMF60對(duì)ConA促進(jìn)小鼠原代脾淋巴細(xì)胞增殖有協(xié)同作用的趨勢(shì)。

3討論

CSMP60是發(fā)酵蟲(chóng)草菌粉經(jīng)水提而得的多糖，雖多糖已被公認(rèn)是一類具有免疫活性的物質(zhì)，但不同來(lái)源多糖的免疫活性往往不盡相同。目前對(duì)CSMP60如何發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用，具體涉及到哪些效應(yīng)細(xì)胞及細(xì)胞因子等問(wèn)題還不是十分清楚，需要相應(yīng)的實(shí)驗(yàn)研究作出回答。

脾臟含有大量的淋巴細(xì)胞和巨噬細(xì)胞，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，CSMP60能促進(jìn)脾細(xì)胞增殖，而在協(xié)同絲裂原促進(jìn)脾淋巴細(xì)胞增殖方面卻未見(jiàn)到CSMP60有明顯的作用，這提示，巨噬細(xì)胞可能是CSMP60直接作用的主要免疫效應(yīng)細(xì)胞。

CSMP60能促進(jìn)巨噬細(xì)胞分泌TNFα，但對(duì)脾淋巴細(xì)胞分泌IFNγ的影響僅呈現(xiàn)出促進(jìn)的趨勢(shì)。TNFα主要是由活化單核巨噬細(xì)胞產(chǎn)生的細(xì)胞因子，是參與非特異性和特異性免疫的重要遞質(zhì)，它不僅能增強(qiáng)T、B淋巴細(xì)胞、單核巨噬細(xì)胞的活性，而且還具有抗腫瘤、抗病毒、調(diào)節(jié)機(jī)體代謝等多種生物學(xué)作用[11]。

綜上所述，CSMP60是發(fā)酵蟲(chóng)草菌粉產(chǎn)生免疫活性的效應(yīng)物質(zhì)之一，可能主要通過(guò)非特異性免疫途徑發(fā)揮作用，而通過(guò)TNFα這一“橋梁”，CSMP60對(duì)特異性免疫或許也有作用。對(duì)CSMP60免疫活性的進(jìn)一步了解以及相關(guān)機(jī)制的探討，還需進(jìn)行深入的研究。

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（2018-03-31收稿責(zé)任編輯：王明）