HSCCC分離純化未成熟羅漢果皂苷類化合物

吳佩娟 盧鳳來 羊?qū)W榮 符毓夏 李典鵬

摘 要：為建立高速逆流色譜分離未成熟羅漢果中皂苷類化合物的方法，該研究將羅漢果粗提物先經(jīng)過大孔樹脂富集皂苷類化合物，再采用高速逆流色譜分離羅漢果皂苷。結(jié)果表明：以氯仿-甲醇-正丁醇-水（5∶6∶1∶4，v/v/v/v）作為兩相溶劑系統(tǒng)，上相為固定相，下相為流動相，在主機轉(zhuǎn)速為860 r·min-1，流速為2.5 mL·min-1，檢測波長為203 nm的條件下，一次性制備得到4個化合物，即11-O-羅漢果皂苷Ⅱ（Ⅰ）、羅漢果皂苷ⅡE（Ⅱ）、11-O-羅漢果皂苷Ⅲ（Ⅲ）和羅漢果皂苷Ⅲ（Ⅳ），經(jīng)高效液相色譜檢測純度分別為95.5%、98.2%、80.1%和97.6%。該方法實現(xiàn)了未成熟羅漢果皂苷快速有效的分離，具有樣品回收率高、損失少、避免樣品失活等優(yōu)點，提高了分離效率。該研究結(jié)果為更多的羅漢果皂苷化合物的分離純化奠定了基礎(chǔ)，補充與優(yōu)化了羅漢果皂苷類化合物的分離方法。

關(guān)鍵詞：高速逆流色譜，未成熟羅漢果，羅漢果皂苷ⅡE，11-O-羅漢果皂苷Ⅱ，羅漢果皂苷Ⅲ，11-O-羅漢果皂苷Ⅲ

中圖分類號：Q946.83

文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A

文章編號：1000-3142（2018）05-0545-07

Abstract：We established a method for separating mogrosides from unripe Siraitia grosvenorii by High-speed countercurrent chromatography （HSCCC）. Crude mogrosides fraction was enriched by macroporous resin method，and then separated by HSCCC. The two-phase solvent system composed of chloroform-methanol-n-butanol-water（5∶6∶1∶4，v/v/v/v） was used for separation. The upper phase was used as the stationary phase，while the lower phase as the mobile phase. The rotation speed was 860 r·min-1，the flow rate was 2.5 mL·min-1，and the detection wavelength was 203 nm. 11-O-mogroside Ⅱ，mogroside Ⅱ E，11-O-mogroside Ⅲ and mogroside Ⅲ，four compounds were prepared in one step，with the purity of 95.5%，98.2%，80.1% and 97.6%，respectively. This method that has the advantages of high sample recovery rate，low loss and avoiding sample inactivation，which successfully realized the rapid and effective separation of mogrosides. Hence，HSCCC can improve separation efficiency and provide theoretical foundation for the separation and purification of moremogrosides，complementing and optimizing the method for separating mogrosides.

Key words：high-speed countercurrent chromatography （HSCCC），unripe Siraitia grosvenorii，mogroside Ⅱ E，11-O-mogroside Ⅱ，mogroside Ⅲ，11-O-mogroside Ⅲ

羅漢果（Siraitia grosvenorii）是羅漢果屬多年生藤本植物，具有清熱潤肺、利咽開音、滑腸通便等功效（中華人民共和國藥典，2015），同時具有抗炎、抗氧化、降血壓（李典鵬和張厚瑞，2000）、降血糖（何超文等，2012）以及防癌抗癌（Patlolla & Rao，2012）等作用。由于低溫、植株營養(yǎng)消耗等因素影響，在采收季末有約四分之一的果實不能正常成熟，這部分含大量的帶苦味羅漢果皂苷ⅡE（李典鵬等，2006）、其次為羅漢果皂苷Ⅲ、11-O-羅漢果皂苷Ⅱ（Li et al，2006）和極少量的11-O-羅漢果皂苷Ⅲ。課題組的前期實驗“羅漢果總皂苷及其組分的吸收和代謝特點研究”中，表明羅漢果皂苷能以二糖苷的形式進(jìn)入血液，黃振聰（2013）在研究羅漢果皂苷V的體內(nèi)外代謝實驗中，發(fā)現(xiàn)血漿中唯一檢測到的代謝成分為羅漢果皂苷ⅡE，其可能為活性物質(zhì)。Suzuki et al（2005）發(fā)現(xiàn)羅漢果皂苷Ⅲ具有抑制麥芽糖酶的作用，通過抑制麥芽糖酶活性而在大鼠中發(fā)揮抗高血糖作用。Li et al（2007）在未成熟羅漢果成分研究中，發(fā)現(xiàn)羅漢果皂苷ⅡE、羅漢果皂苷Ⅲ、11-O-羅漢果皂苷Ⅱ和11-O-羅漢果皂苷Ⅲ具有抑制SMMC-7721和HCT-116的作用。因此，需要找到快速、簡便的方法分離純化未成熟羅漢果中的皂苷類成分，為更多藥理實驗的展開提供基礎(chǔ)。

羅漢果皂苷類化合物具有共同的苷元—葫蘆烷型四環(huán)三萜羅漢果醇，它們的結(jié)構(gòu)主要區(qū)別在于連接糖基的個數(shù)以及11位氧化與否，因而極性相近，造成分離純化困難。目前，羅漢果主要采用傳統(tǒng)柱色譜法進(jìn)行分離，高效液相色譜法（high performance liquid chromatography，HPLC）來純化，存在工作量大、分離時間長、溶劑消耗多以及樣品損失嚴(yán)重等問題，因此，需要找到簡便快速的方法分離純化羅漢果皂苷，從而提高分離效率。

高速逆流色譜法（high-speed countercurrent chromatography，HSCCC）是一種液—液色譜分離技術(shù)，不需要用固態(tài)的支撐物或載體，具有樣品回收率高、制備量大、避免樣品失活變性、且操作具靈活性和多功能性等優(yōu)點，能有效地保留活性成分，在快速篩選活性物質(zhì)的制備方法中具有突出優(yōu)勢，因此，在天然產(chǎn)物研究、開發(fā)等方面存在巨大潛力（曹學(xué)麗，2005；汪永玲等，2017）。雖然HSCCC常用于分離其它皂苷類化合物（黃玉艾等，2013；Shehzad et al，2011，2012），但幾乎未用于羅漢果皂苷的分離純化，該實驗先經(jīng)大孔樹脂富集得到未成熟羅漢果皂苷粗提物，再經(jīng)HSCCC分離純化，一次性得到3個較高純度的化合物：11-O-羅漢果皂苷Ⅱ（Ⅰ）、羅漢果皂苷ⅡE（Ⅱ）、羅漢果皂苷Ⅲ（Ⅳ）和1個純度較低的化合物：11-O-羅漢果皂苷Ⅲ（Ⅲ），實現(xiàn)了皂苷化合物快速有效的分離純化，為優(yōu)化以及拓展羅漢果皂苷的分離方法提供了一定的參考依據(jù)。

1 儀器、材料與方法

1.1 儀器

TBE-300C型高速逆流色譜儀（上海同田生物技術(shù)股份有限公司）、聚四氟乙烯螺旋管（內(nèi)徑，主機容量300 mL）、進(jìn)樣圈（體積20 mL）、TBP-5002恒流泵、UV-2000D紫外檢測器、DC-0506低溫恒溫槽；BS110S賽多利斯電子天平（北京賽多利斯天平有限公司）；miVac真空離心濃縮儀（英國GeneVac公司）；CHF161RA分餾貯存器（日本Advantec公司）；高效液相色譜儀（日本島津公司）；KQ3200DE型數(shù)控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）。

1.2 材料和試劑

材料：未成熟羅漢果（標(biāo)本保存于廣西植物研究所廣西植物功能物質(zhì)研究與利用重點實驗室）。試劑：大孔樹脂和高速逆流色譜所用甲醇、氯仿、正丁醇均為分析純（西隴化工股份有限公司）；高效液相色譜所用甲醇、乙腈均為色譜純（美國TEDIA公司）；娃哈哈飲用純凈水；D101型大孔樹脂。

1.3 方法

1.3.1 羅漢果皂苷粗提物的制備 從市場上購買的未成熟羅漢果，去殼，羅漢果果囊用95%乙醇浸泡，提取液進(jìn)行減壓濃縮，得乙醇浸膏，將浸膏水溶，所得水溶液進(jìn)行離心，上清液經(jīng)大孔吸附樹脂柱色譜分離，以40%、60%、80%、100%甲醇-水梯度洗脫，收集甲醇洗脫液，減壓濃縮得4部分浸膏。經(jīng)高效液相分析檢測，色譜條件：ZORBAX SB-C18柱（4.6 mm × 250 mm，5 μm）；流動相A為乙腈，流動相B為水；梯度洗脫為10% A～18% A 0～10 min，18% A～28% A 10～20 min，28% A～45% A 20～35 min，45% A～54% A 35～40 min；流速為1.0 mL·min-1；檢測波長為203 nm；柱溫為35 ℃；進(jìn)樣量為30 μL。所得液相圖譜見圖2，由圖2可知羅漢果皂苷主要在60%甲醇洗脫部分，將其進(jìn)行濃縮干燥，備用。

1.3.2 HSCCC溶劑體系及樣品溶液的制備 將氯仿-甲醇-正丁醇-水溶劑系統(tǒng)按體積比為5∶6∶1∶4置于分液漏斗中，劇烈振蕩使其充分混合后靜置分層，上相為固定相，下相為流動相，分別超聲脫氣20 min，備用。稱取150 mg羅漢果粗提物，分別用5 mL上相和5 mL下相進(jìn)行充分溶解，備用。

1.3.3 HSCCC的分離制備過程 開啟低溫恒溫槽，設(shè)定溫度為25 ℃，將兩相溶劑體系中已超聲脫氣的上相（固定相）以30 mL·min-1的流速泵入HSCCC分離柱中，待聚四氟乙烯線圈內(nèi)充滿固定相并流出一定體積的固定相后，開動主機，設(shè)置轉(zhuǎn)速至860 r·min-1，主機正轉(zhuǎn)，同時，以2.5 mL·min-1的流速泵入流動相，至流出流動相且工作站的基線穩(wěn)定后，即為平衡，將10 mL樣品溶液注入HSCCC中，采用紫外檢測器檢測，波長為203 nm，開始采集數(shù)據(jù)，用分餾貯存器每隔5 min收集餾分。

1.3.4 HPLC檢測分析 所得各餾分經(jīng)真空離心濃縮減干燥得到化合物，取各組分，分別用適量色譜甲醇溶解后進(jìn)HPLC檢測分析，采用峰面積歸一化法，計算制備得到的各目標(biāo)化合物的純度。色譜條件同1.3.1節(jié)。

2 結(jié)果與分析

2.1 HSCCC分離條件的優(yōu)化

2.1.1 溶劑體系的篩選 根據(jù)目標(biāo)化合物的極性（丁瓊，2014）和參考相關(guān)文獻(xiàn)（Cao et al，2003；符曉暉等，2017；Cheng et al，2011；Yao et al，2008），選擇乙酸乙酯-正丁醇-水和氯仿-甲醇-正丁醇-水兩種溶劑體系，按表1中各溶劑體系比例分別往分液漏斗中加入溶劑，上下充分振搖，靜置后分液，稱取羅漢果皂苷粗提物5 mg置于具塞試管中，分別精確量取上相、下相溶液各4 mL溶解樣品，充分震蕩溶解，待兩相平衡后，分別精確量取上下兩相溶液各2 mL于小瓶中，濃縮干燥，再分別用1.0 mL色譜甲醇溶解，經(jīng)HPLC檢測分析，上相峰面積為AU，下相峰面積為AL，計算不同溶劑系統(tǒng)中目標(biāo)化合物的分配系數(shù)（K，K=AU/AL）以及相應(yīng)的分離度（α），見表1。

羅漢果皂苷ⅡE、11-O-羅漢果皂苷Ⅱ以及羅漢果皂苷Ⅲ、 11-O-羅漢果皂苷Ⅲ它們兩兩之間的結(jié)構(gòu)、極性極其相似，從表1可以看出，乙酸乙酯-正丁醇-水溶劑體系中KⅠ、KⅡ以及KⅢ、KⅣ之間的值較為相近，分配系數(shù)差異小，分離度降低，所以選擇氯仿-甲醇-正丁醇-水溶劑體系進(jìn)行實驗，并且比較該體系下三種不同體積比的體系，因體積比為5∶6∶1∶4的溶劑體系具有較合適的K和α值，各組分基本可以實現(xiàn)基線分離，所以選擇氯仿-甲醇-正丁醇-水（5∶6∶1∶4，v/v/v/v）作為本研究的兩相溶劑系統(tǒng)。

2.1.2 轉(zhuǎn)速對固定相保留率的影響 高速逆流色譜儀器的主機轉(zhuǎn)速范圍為0～900 r·min-1，在其它實驗條件（流速、溫度）都相同的情況下，從800 r·min-1開始，依次增加轉(zhuǎn)速，計算固定相的保留率（Sf）（曹學(xué)麗，2005），結(jié)果見圖3。在一定范圍內(nèi)，隨著主機轉(zhuǎn)速增加，靜態(tài)（未進(jìn)樣）保留率呈較緩慢的趨勢增大，固定相保留越多，分離效率越高；但若轉(zhuǎn)速過大，易使粘性較大的溶劑體系產(chǎn)生乳化現(xiàn)象，造成動態(tài)（已進(jìn)樣）固定相流失較多，從而影響分離效果。最終選擇的轉(zhuǎn)速為860 r·min-1，其保留率為78.7%。

2.1.3 流速、樣品濃度的確定 以2.0、2.3和2.5 mL·min-1的流速進(jìn)行洗脫，當(dāng)流速為2.0 mL·min-1時，洗脫到380 min，化合物Ⅳ（K值為3.469，K值越大，洗脫時間越長）未被洗脫出來，這不但耗時，而且還浪費溶劑；當(dāng)流速提高到2.5 mL·min-1時，化合物Ⅳ在285 min被洗脫出來。因此，通過適當(dāng)提高流速，可相應(yīng)縮短分離時間，最終選擇的流速為2.5 mL·min-1。以樣品濃度為7.5、8.6、12.5、15.0和20.0 mg·mL-1進(jìn)樣，若濃度太大（如20.0 mg·mL-1），會出現(xiàn)平頭峰，且峰之間有交叉，影響分離效果；若濃度太?。ㄈ?.5 mg·mL-1），則峰響應(yīng)值較弱。HSCCC適用于濃度高、體積大的樣品溶液的分離純化，但是樣品溶液相對于溶劑系統(tǒng)有不同的理化性質(zhì)，當(dāng)樣品過載進(jìn)入到系統(tǒng)中，在樣品被充分稀釋之前，它被看作是第三相（相對于兩相溶劑體系），從而有可能破壞溶劑體系的平衡，造成固定相的損失，從而影響分離效果（Peng et al，2016），最終選擇15.0 mg·mL-1的樣品濃度進(jìn)樣。

2.2 HSCCC分離的結(jié)果

以氯仿-甲醇-正丁醇-水（5∶6∶1∶4，v/v/v/v）作為兩相溶劑系統(tǒng)，上相作為固定相，下相作為流動相，按照1.3.3節(jié)實驗操作方法將1.3.2節(jié)中已制備好的樣品溶液進(jìn)HSCCC分離純化，用分餾貯存器每隔5 min接收餾分。先將所得的各餾分進(jìn)行HPLC檢測分析，分別合并含目標(biāo)化合物且純度較高的餾分，進(jìn)行真空濃縮干燥，各目標(biāo)化合物再經(jīng)HPLC檢測分析，HPLC圖譜見圖4，最后進(jìn)行稱量得到11-O-羅漢果皂苷Ⅱ（Ⅰ） 3.7 mg、羅漢果皂苷ⅡE（Ⅱ） 40.6 mg、11-O-羅漢果皂苷Ⅲ（Ⅲ） 0.9 mg和羅漢果皂苷Ⅲ（Ⅳ） 5.2 mg，純度分別為95.5%、98.2%、80.1%和97.6%。

3 討論與結(jié)論

未成熟羅漢果中的皂苷類化合物的結(jié)構(gòu)和性質(zhì)非常相似，造成分離純化的困難。據(jù)文獻(xiàn)報道：Li et al（2007）對未成熟羅漢果皂苷的提取采用Diaion HP-20大孔樹脂、硅膠柱層析、Sephadex LH-20凝膠柱和ODS反相柱等方法；斯建勇等（1996）通過大孔樹脂、硅膠柱、Al2O3柱和RP2反相柱等多種柱層析進(jìn)行反復(fù)洗脫來分離羅漢果三萜化合物，由此可看出，采用傳統(tǒng)柱層析方法進(jìn)行分離不但耗材耗時而且操作繁瑣，降低了實驗效率。該實驗采用HSCCC法對已富集的目標(biāo)組分進(jìn)行分離純化，并通過優(yōu)化HSCCC分離條件，實現(xiàn)快速有效的分離，一次性制備得到3個高純度的皂苷化合物：羅漢果皂苷ⅡE、11-O-羅漢果皂苷Ⅱ和羅漢果皂苷Ⅲ，從而大大提高了分離效率。本研究不足之處在于：（1）皂苷類化合物的紫外吸收（203 nm）接近于末端吸收，本實驗在HSCCC分離中所用的檢測器為紫外檢測器，目標(biāo)化合物的吸收峰較弱，因而所得的餾分需經(jīng)過HPLC檢測，再進(jìn)行合并得到目標(biāo)組分，因此，如有條件，在進(jìn)行皂苷類化合物的分離時，應(yīng)采用蒸發(fā)光散射檢測器，以提高檢測靈敏度。（2）11-O-羅漢果皂苷Ⅲ在樣品中的含量極少，制備純度不高，需進(jìn)一步富集再純化。與傳統(tǒng)的柱色譜法、HPLC制備方法相比，HSCCC以其進(jìn)樣量大、樣品無損失、活性無影響和操作簡便等特點，使羅漢果苦苷得到快速、高效地分離純化。運用HSCCC法相當(dāng)于放大了分離、制備過程，為更多的藥理實驗研究提供基礎(chǔ)，使未成熟的羅漢果得到充分開發(fā)利用，避免資源的浪費，為優(yōu)化及拓展分離純化羅漢果皂苷類化合物提供了一定的參考依據(jù)，同時為快速篩選天然產(chǎn)物中的活性成分提供方法路徑。

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