葛根芩連湯配方顆粒和傳統(tǒng)湯劑的HPLC的指紋圖譜對比研究

李紅　李妍　田杰　王艷　張穎

摘要 目的：采用高效液相（HPLC）比較研究葛根芩連湯配方顆粒劑和傳統(tǒng)湯劑的指紋圖譜差異。方法：首先選擇3家不同醫(yī)院A、B、C的葛根芩連湯配方顆粒劑和傳統(tǒng)湯劑，配制對照品溶液和供試品溶液后，以優(yōu)化的色譜條件進(jìn)行HPLC指紋圖譜研究。結(jié)果：HPLC中間精密度試驗、重復(fù)性試驗和穩(wěn)定性試驗均顯示良好。葛根芩連湯顆粒劑HPLC指紋圖譜發(fā)現(xiàn)前5 min K1、K2和K3的譜圖差異較大，5 min后3家不同醫(yī)院葛根芩連湯顆粒劑HPLC指紋圖譜有10個相似的特征峰，其中K3特征峰的成分含量與K1和K2存在較大差異，尤其是1號峰和4號峰。K1和T1、K2和T2、K3和T3顆粒劑和傳統(tǒng)湯劑的比較中，顆粒劑特征峰的含量較傳統(tǒng)湯劑高。結(jié)論：葛根芩連湯配方不同醫(yī)院顆粒劑和傳統(tǒng)湯劑的HPLC指紋圖譜存在一定差異。

關(guān)鍵詞 高效液相；指紋圖譜；葛根芩連湯；精密度；重復(fù)性；加樣回收；穩(wěn)定性；專屬性

Abstract Objective：To compare the fingerprints of Gegen Qinlian Formula granules and its traditional decoction by high performance liquid phase （HPLC）.Methods：Gegen Qinlian Decoction Formula granules and traditional decoctions from 3 different hospitals A，B，C，were selected.After preparing the control solution and test solution，the HPLC fingerprint analysis was carried out under the optimized chromatographic conditions.Results：The results of HPLC intermediate precision test，repeatability test and stability test were all good.Gegen Qinlian Decoction granules HPLC fingerprint showed that the spectra of K1，K2 and K3 differed greatly during the first 5 min.Then after the 5 min，HPLC fingerprint of Gegen Qinlian Decoction Formula granules from 3 different hospitals had 10 similar characteristic peaks，the content of K3 characteristic peak was quite different from K1 and K2，especially No.1 and No.4 peaks.In comparison of K1 and T1，K2 and T2，K3 and T3 of granules and traditional decoctions，the content of the characteristic peak of granules was higher than that of traditional decoctions.Conclusion：There are certain differences in the HPLC fingerprints of Gegen Qinlian Decoction granules and traditional decoction from different hospitals.

Key Words High performance liquid phase； Fingerprint； Gegen Qinlian Decoction； Precision； Repeatability； Sample recovery； Stability； Specificity

中圖分類號：R283.6文獻(xiàn)標(biāo)識碼：Adoi：10.3969/j.issn.1673-7202.2018.09.051

葛根芩連湯是由葛根、黃芩、黃連和甘草組成的經(jīng)典方，該方出自中醫(yī)經(jīng)典《傷寒論》，屬于表里雙解劑，即可清解衛(wèi)表，又可清里瀉熱，適用于傷寒表證未解，邪入陽明而致的邪熱下利證，即現(xiàn)代醫(yī)學(xué)的腹瀉、痢疾等[1-2]。全方以葛根為君，辛甘涼入脾胃經(jīng)，對因表證未解，里熱已熾而引起的身熱口渴、胸悶口干等癥狀行解表退熱之功，對因熱邪內(nèi)迫，大腸傳導(dǎo)失司致下利臭穢和肛門灼熱等癥狀行升陽止利之效；黃芩、黃連助君藥解表清里，燥濕止利，其中黃芩“主治諸經(jīng)實熱……瀉肺火，清痰利氣”，對肺之里熱上蒸致咳致喘，具有解肌汗出而解之功；甘草調(diào)和諸藥而為佐使。傳統(tǒng)的中藥湯劑具有不方便攜帶，熬藥時間較長等不足，而生活節(jié)奏較快又想服用中藥的患者則感到不便。近年來出現(xiàn)的中藥配方顆粒劑，以其配方的全成分提取而制成，使患者服用中藥更加省時便捷，攜帶方便[3-5]。對于配方顆粒劑與傳統(tǒng)湯劑中指紋圖譜是否存在差異，目前研究較少。本研究基于葛根芩連湯，采用HPLC指紋圖譜比較的方法研究其配方顆粒和傳統(tǒng)湯劑的差異，報道如下。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 購于安捷倫科技（中國）有限公司的高效液相色譜儀（型號Agilent-1100）、四元泵（型號G1321）和二極管陣列檢測器（型號G1315DAD）等；購于青島君道生物技術(shù)有限公司的Ultimate AQ C18柱。

1.2 試劑 購于上海展云化工有限公司色譜HPLC乙腈和色譜HPLC甲醇；中國食品藥品檢定研究院提供的超純水和葛根素對照品（110752-200410）。

1.3 分析樣品 隨機選取A、B、C 3家不同醫(yī)院的葛根芩連湯顆粒劑和湯劑進(jìn)行比較研究，其中A醫(yī)院葛根芩連湯配方顆粒劑K1為神威藥業(yè)集團(tuán)有限公司，葛根17050211，每袋1.5 g相當(dāng)于飲片15 g；黃芩17062171，每袋0.9 g相當(dāng)于飲片10 g；炙甘草17062321，每袋0.6 g相當(dāng)于飲片3 g；黃連17052811，每袋0.5相當(dāng)于飲片3 g；B醫(yī)院顆粒劑K2為廣東一方制藥有限公司，葛根7095323，每袋200 g相當(dāng)于飲片2 000 g；黃芩7105893，每袋200 g相當(dāng)于飲片1 120 g；炙甘草7120593，每袋200 g相當(dāng)于飲片1 000 g；黃連7092273，每袋200 g相當(dāng)于飲片1 200 g；C醫(yī)院顆粒劑K3為東營諾康生物技術(shù)有限公司，葛根990207，每袋200 g相當(dāng)于飲片2 000 g；黃芩981104，每袋100 g相當(dāng)于飲片510 g；炙甘草990209，每袋100 g相當(dāng)于飲片500 g；黃連990210，每袋100 g相當(dāng)于飲片600 g。配方顆粒劑藥物組成均相當(dāng)于中藥飲片葛根30 g，黃芩20 g，炙甘草6 g，黃連6 g，這3家醫(yī)院對應(yīng)的中藥飲片廠家各不同。見表1。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件 采用4.6 mm×250 mm的C18保護(hù)柱（5 μm），以室內(nèi)溫度為柱溫，進(jìn)樣量為20 μL以乙腈為流動相A，甲醇為流動相B，流速1.0 mL/min：檢測波長為280 nm。

2.2 對照品溶液的制備 首先將葛根素對照品放置于60 ℃真空干燥至恒重，然后分別精密稱取10.3、5.3 mg于50 mL量瓶中，加入50%甲醇適量并超聲溶解，混合均勻后制成葛根素對照品溶液。

2.3 供試品溶液的制備 根據(jù)葛根芩連湯的配伍比例，即葛根15 g、黃連9 g、甘草6 g、黃芩9 g。根據(jù)3家不同醫(yī)院提供的藥材，采用傳統(tǒng)湯劑煎煮方法，先煮葛根后入諸藥得200 mL濃縮混合藥液，采用0.45 μm微孔濾膜過濾混合藥液制成供試品溶液。葛根芩連湯同配比對應(yīng)顆粒劑以水溶解，直至完全無可見沉淀物即為顆粒劑供試品溶液。

2.4 專屬性試驗 取同一供試品溶液根據(jù)2.3制備的供試品溶液，采用HPLC色譜法對葛根芩連湯進(jìn)行專屬性試驗，結(jié)果顯示葛根芩連湯專屬性良好。

2.5 線性關(guān)系考察 精密量取葛根素對照品的甲醇溶液3.0、6.0、12.0、18.0、24.0 mL，分別置50 mL量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻后分別精密吸取10 μL，采用HPLC色譜法，記錄峰面積；以對照品進(jìn)樣量（μg）為橫坐標(biāo)（X，峰面積積分值為縱坐標(biāo)（Y），繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，葛根素回歸方程y=2.269 3X+29 028，r=0.999 1（n=5），結(jié)果表明，葛根素對照品在5.03～504.06 μg/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.6 中間精密度試驗 精密取同一2.3制備的供試品溶液，在一組相同的測量程序、相同地點等測量條件下，對被測對象在一長時間段內(nèi)重復(fù)測量進(jìn)行中間精密度試驗，本研究重復(fù)測量5次，大于總峰面積5%的色譜峰相對峰面積精密度結(jié)果最終取平均值，研究結(jié)果顯示葛根芩連湯供試品溶液中間精密度良好。見表2。

2.7 供試品溶液穩(wěn)定性試驗 由于固定相的穩(wěn)定性都是有限的，因此的HPLC試驗開始前，需要確定供試品溶液的穩(wěn)定性，以保障后續(xù)研究結(jié)果的誤差最小，可靠性最高。本研究采用同一供試品溶液重復(fù)進(jìn)行5次試驗，研究結(jié)果顯示葛根芩連湯供試品溶液穩(wěn)定性良好，平均RSD為1.8%。見表3。

2.8 重復(fù)性試驗 采用同一供試品溶液，連續(xù)進(jìn)樣5次進(jìn)行短時間內(nèi)的連續(xù)重復(fù)性測試，以保證HPLC方法學(xué)的可重復(fù)性，本研究結(jié)果顯示葛根芩連湯的重復(fù)性良好，平均RSD為1.9%。見表4。

2.9 回收率試驗 精密稱取5份已知含量的同一批葛根芩連湯樣品各約0.5 g，分別精密加入20 mL混合對照品甲醇溶液，采用加樣回收法測定，計算結(jié)果顯示平均回收率為99.09%，RSD為0.78%。

2.10 樣品測定結(jié)果 由圖1、圖2和圖3中葛根芩連湯顆粒劑HPLC指紋圖譜發(fā)現(xiàn)前5 min K1、K2和K3的譜圖差異較大，然后5 min后3個不同醫(yī)院葛根芩連湯顆粒劑HPLC指紋圖譜有10個相似的特征峰，其中K3特征峰的成分含量與K1和K2存在較大差異，尤其是1號峰和4號峰。K1和T1、K2和T2、K3和T3顆粒劑和傳統(tǒng)湯劑的比較中，顆粒劑特征峰的含量較傳統(tǒng)湯劑高。

3 討論

隨著現(xiàn)代科學(xué)技術(shù)對中藥復(fù)方研究的不斷深入發(fā)掘，中藥復(fù)方的制劑工藝和制劑質(zhì)量等都有所提高，因此不斷致力于將中藥推向現(xiàn)代化具有重要的意義。20世紀(jì)末對中藥復(fù)方研究制備方法分為分煎和合煎[6]，本研究中葛根芩連湯配方顆粒劑屬于分煎的范疇[7-8]，而傳統(tǒng)湯劑屬于合煎的范疇[9]。而中藥復(fù)方無論是藥物分煎后混合和傳統(tǒng)湯劑合煎，與單味藥物比較，其化學(xué)成分含量均會產(chǎn)生變化，研究者就半夏和生姜，單味藥物分煎與合煎進(jìn)行比較，HPLC指紋圖譜結(jié)果顯示，合煎后存在色譜峰含量變化[10]。本研究結(jié)果顯示，顆粒劑指紋圖譜K3與K1、K2存在一定差異，T1、T2和T3指紋圖譜未見明顯差異，可能與不同醫(yī)院對應(yīng)的藥材及相應(yīng)的制作設(shè)備、工藝流程等存在差異有關(guān)[11]。有研究[12]以指紋圖譜層方式研究補腎方配方顆粒劑和傳統(tǒng)湯劑，通過HPLC的研究方法考察最佳的檢查波長，并結(jié)合不同品牌的C18色譜柱不斷的優(yōu)化其HPLC的色譜條件后，研究結(jié)果顯示補腎方配方顆粒劑和傳統(tǒng)湯劑提取物中指紋圖譜存在差異，其中配方顆粒劑的主要化學(xué)成分提取率大于傳統(tǒng)湯劑。本研究結(jié)果顯示，K1和T1、K2和T2、K3和T3顆粒劑和傳統(tǒng)湯劑的比較，顆粒劑特征峰的含量較傳統(tǒng)湯劑高，提示葛根芩連湯配方顆粒劑和傳統(tǒng)湯劑的指紋圖譜存在差異，而這種差異可能是由于復(fù)方合煎與分煎時化學(xué)成分的差異而導(dǎo)致的。如果葛根芩連湯配方顆粒劑和傳統(tǒng)湯劑在化學(xué)成分上存在差異[13-14]，則兩者間在藥效上也必然存在差異。近年來，中藥復(fù)方的配方顆粒劑與傳統(tǒng)湯劑在藥效學(xué)上的差異受到了廣泛關(guān)注，而在研究配方顆粒劑與傳統(tǒng)湯劑的問題時，應(yīng)該結(jié)合藥效學(xué)從復(fù)方整體分析評價配方顆粒劑與傳統(tǒng)湯劑的優(yōu)劣[15-18]；具體差異的化學(xué)成分和藥效比較，本研究并未展開，后續(xù)可配合質(zhì)譜、紅外光譜等進(jìn)行深入研究。

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（2018-05-07收稿 責(zé)任編輯：張雄杰）