Pi-ta、Pi-5、Pi-km和Pi-b基因在粳稻品種（系）中的分布及對(duì)穗頸瘟的抗性

張善磊 孫旭超 陳濤 趙春芳 朱鎮(zhèn) 趙慶勇 周麗慧 趙 凌 姚姝 王才林

摘要：利用稻瘟病抗性基因Pi-ta、Pi-5、Pi-km、Pi-b的功能標(biāo)記，對(duì)國(guó)內(nèi)外238份粳稻品種（系）進(jìn)行基因檢測(cè)，結(jié)合穗頸瘟鑒定結(jié)果，明確4個(gè)抗性基因的區(qū)域分布特點(diǎn)，評(píng)估其對(duì)穗頸瘟的抗性效果。Pi-ta和Pi-b主要分布在東北、長(zhǎng)江中下游及西南地區(qū)品種（系）中，P1-5和Pi-km在西南地區(qū)品種中的分布高于其他地區(qū)。238份粳稻品種（系）中含Pi-ta、Pi-5、Pi-km、Pi-b單個(gè)抗性基因的品種（系）分別有33、30、29和38份;含2個(gè)抗性基因的品種（系）共有66份，其中含Pi-ta/Pi-b的品種（系）最多，有28份;同時(shí)含3個(gè)抗性基因的品種（系）有12份;4個(gè)基因均不含有的品種（系）有30份。Pi-ta對(duì)穗頸瘟的抗性效果最好，感病率為O，病情指數(shù)為22. 73;其次是P1-5和P/-km基因，病情指數(shù)分別為59. 17和70. 69;Pi-b對(duì)穗頸瘟的抗性效果最差，感病率為86. 840/0，病情指數(shù)為83. 55。雙基因組合對(duì)穗頸瘟的抗性效果依次為：Pi-ta/P1-5>Pi-ta/Pi-km>Pi-ta/Pi-b>Pi-5/Pi-km;3份同時(shí)含有Pi-ta、Pi-5、Pi-km， 3基因的品種表現(xiàn)出最強(qiáng)的穗頸瘟抗性。

關(guān)鍵詞：粳稻;穗頸瘟;抗性基因;分子標(biāo)記

中圖分類號(hào)：S511.2+20.34

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

文章編號(hào)： 1000-4440（ 2018） 05-0961-11

稻瘟病是由子囊菌[Magn，aporthe grisea（He-bert） Barr，無(wú)性態(tài)Pyricularia grisea（Cooke） Sacc.]引起的強(qiáng)流行性農(nóng)作物病害之一，如遇高溫、高濕的適宜環(huán)境條件，短期即可爆發(fā)流行。近年來(lái)，中國(guó)局部地區(qū)在2006年、2014年和2015年出現(xiàn)稻瘟病的大爆發(fā)和大流行、據(jù)統(tǒng)計(jì)，3年發(fā)病面積均超出5.0x106hm2，造成的實(shí)際產(chǎn)量損失均超過(guò)5.0x 105t。稻瘟病一直是水稻生產(chǎn)的重要病害，尤以穗頸瘟威脅最大。水稻穗期病菌侵入穗部形成暗褐色小點(diǎn)，后逐漸擴(kuò)展到整個(gè)穗頸，使穗頸壞死，阻斷養(yǎng)分輸送，從而造成白穗，輕則減產(chǎn)10%～20%，重則減產(chǎn)40%—50%以上，個(gè)別重發(fā)田塊甚至絕收。

生產(chǎn)上依賴噴施化學(xué)藥劑防治稻瘟病，不僅會(huì)增加種植成本，還會(huì)帶來(lái)環(huán)境污染和食品安全等問(wèn)題。并且稻瘟病菌生理小種不斷演化，抗藥性逐漸增強(qiáng)。實(shí)踐表明，選育和推廣抗病品種是防治該病流行最經(jīng)濟(jì)、有效的手段。隨著分子生物學(xué)和基因組學(xué)研究的深入，迄今為止，至少有350個(gè)微效QTL和86個(gè)主效抗病基因被報(bào)道，這些基因成簇地分布于水稻染色體上，其中有24個(gè)基因已被成功克隆，且Pi-ta、Pi-5、Pi-km和Pi-b等至少16個(gè)抗性基因均已開(kāi)發(fā)出功能標(biāo)記。

Pi-ta與Pi-b是最早克隆的稻瘟病抗性基因，被認(rèn)為具有廣譜、持久抗性，已報(bào)道對(duì)江蘇省粳稻穗頸瘟具有明顯抗性。Pi-km由2個(gè)獨(dú)立功能緊密連鎖的NBS-LRR類基因（Pi-kml-TS和Pi-km2-TS）組成，是pi位點(diǎn)上的一個(gè)主效抗病等位基因。王軍等研究發(fā)現(xiàn)，Pi-ta、Pi-b和Pi-km與江蘇省穗頸瘟抗性呈正相關(guān)，相關(guān)系數(shù)分別為0. 81、0.11和0.15。范方軍等研究發(fā)現(xiàn)含Pi-ta或Pi-b、Pi-km和Pi54的3個(gè)基因組合材料的穗頸瘟抗性無(wú)4級(jí)高感，而其他抗性基因組合一般都存在4級(jí)高感。Pi-5與Pi-km，類似，是含2個(gè)獨(dú)立的NBS-LRR類抗性基因。楊小林等研究發(fā)現(xiàn)Pi-5對(duì)湖北地區(qū)穗頸瘟具有很好的抗性表現(xiàn)。鄭文靜等[23]研究發(fā)現(xiàn)Pi-5單基因系對(duì)遼寧地區(qū)15個(gè)生理小種中的12個(gè)小種表現(xiàn)為中抗或抗病，抗譜較寬，是一個(gè)在遼寧地區(qū)可廣為利用的廣譜稻瘟病抗性基因，但其與江蘇省穗頸瘟抗性關(guān)系還不是很清楚。因此，進(jìn)一步明確Pi-ta、Pi-b、Pi-5、Pi-km抗性基因在粳稻栽培品種中的分布及與穗頸瘟的抗性關(guān)系，對(duì)粳稻稻瘟病抗性育種中親本材料的選擇具有重要意義。

本研究利用稻瘟病抗性基因Pi-ta、Pi-5、Pi-km、Pi-b的功能標(biāo)記，對(duì)國(guó)內(nèi)外238份粳稻品種（系）進(jìn)行基因型檢測(cè)，分析這些抗性基因在供試材料中的區(qū)域分布和利用狀況;通過(guò)穗頸瘟田間抗性鑒定，評(píng)價(jià)單基因及不同基因組合對(duì)穗頸瘟的抗性效果。本研究旨在分析稻瘟病抗性基因在粳稻栽培品種穗頸瘟抗性改良中的利用價(jià)值，為稻瘟病抗性育種提供可靠的種質(zhì)資源。

1 材料與方法

1.1 供試材料

供試材料為238份粳稻，包括：國(guó)內(nèi)粳稻品種（系）222份，其中，東北地區(qū)粳稻品種21份、華北地區(qū)粳稻品種13份、長(zhǎng)江中下游地區(qū)粳稻品種（系）167份、西北地區(qū)粳稻品種11份、西南地區(qū)粳稻品種10份：國(guó)外粳稻品種16份，含14份日本粳稻、2份韓國(guó)粳稻。以麗江新團(tuán)黑谷及其攜帶Pi-ta、Pi-5、Pi-km、Pi-b的近等基因系為抗性基因?qū)φ詹牧?，編?hào)分別為IRBL32（麗江黑谷）、IRBL13（Pi-ta）、IR-BL20（P1-5）、IRBL25（Pi-km）、IRBL14（Pi-b）。供試材料均種植于江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院糧食作物研究所試驗(yàn)田。5月13日播種，6月13日移栽，每個(gè)品種（系）種植4行，每行12株，株行距13.3 cmx26.7cm，常規(guī)栽培方式管理。

1.2 穗頸瘟接種及抗性統(tǒng)計(jì)

稻瘟病菌供試菌株由江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所提供，包括6個(gè)生理小種，分別為ZB，、ZC11、ZD7、ZE3、ZF1和ZG1，菌株均來(lái)自江蘇省蘇州市、連云港市等地。穗頸瘟抗性鑒定方法參照江蘇省水稻品種（系）抗稻瘟病鑒定方法與抗性評(píng)價(jià)技術(shù)規(guī)程（DB32/T1123 2007）。在水稻孕穗破口前，用注射器將6個(gè)小種菌株的混合菌液注入穗苞，每個(gè)品種接種5個(gè)稻穗，稻成熟后期按穗頸瘟調(diào)查標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行調(diào)查記載。分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)為：0級(jí)（免疫），無(wú)病斑：1級(jí)（抗?。?，1/4以下支梗發(fā)病或穗頸有斑點(diǎn)：2級(jí)（中抗），1/4以上支梗發(fā)病或主軸中部發(fā)病，或頸部有病，但對(duì)產(chǎn)量影響不大：3級(jí)（感病），主軸中部或頸部發(fā)病，對(duì)產(chǎn)量有顯著影響;4級(jí)（高感），穗頸發(fā)病造成白穗。

病情指數(shù)=∑（各級(jí)品種數(shù)×各級(jí)代表值）/（總品種數(shù)×最高級(jí)代表值），感病率=（3～4級(jí)品種數(shù)/總品種數(shù)）×100%。

1.3 DNA提取和稻瘟病抗性基因鑒定

水稻分蘗盛期采集各品種（系）幼嫩的新鮮葉片，采用盧揚(yáng)江等的CTAB法并略作修改提取基因組DNA。Pi-ta基因鑒定：由2對(duì)引物Pita和NPi-to分別擴(kuò)增抗病基因型和感病基因型：Pi-5基因鑒定：由3對(duì)引物JJ113-T3、JJ80-T3、JJ81-T3分別進(jìn)行基因型鑒定：Pi-km基因鑒定：由2對(duì)引物Pi-kml和Pikm2分別進(jìn)行基因型鑒定;Pi-b基因鑒定：由2對(duì)引物Pib和NPib分別擴(kuò)增抗病基因型和感病基因型。4個(gè)稻瘟病抗性基因功能標(biāo)記的引物名稱、序列和擴(kuò)增片段大小見(jiàn)表l。引物由上海英濰捷基貿(mào)易有限公司合成。

1.4 PCR擴(kuò)增和電泳檢測(cè)

20μl的PCR反應(yīng)總體系包含：ddH20 14.2μl，模板DNA（20ng/μl）2.0μl， 10×Buffer（25.0mmol/L）2.0μl， dNTP（2.5 mmol/L） 0.4μl，正、反向引物（10μmol/L）0.5μ1， Taq DNA聚合酶（2U/μl）0.4μl。PCR擴(kuò)增反應(yīng)條件：95 aC預(yù)變性4min;95℃變性30s，46—58℃復(fù)性30s，72℃延伸90s，35個(gè)循環(huán);72℃延伸10 min。反應(yīng)產(chǎn)物在2%瓊脂糖凝膠上電泳分離，DuRed核酸染料染色后，在紫外凝膠成像儀上觀察記載。

2 結(jié)果與分析

2.1 Pi-ta.、P/-5、Pi-km和Pi-b功能標(biāo)記的驗(yàn)證及檢測(cè)

利用稻瘟病抗性基因Pi-ta、Pi-5、Pi-km和Pi-b的功能標(biāo)記對(duì)238份粳稻品種（系）進(jìn)行基因型檢測(cè)。Pita引物檢測(cè)出1042 bp的預(yù)期條帶，同時(shí)NPita引物不能檢測(cè)出1 042 bp的預(yù)期條帶，則該品種（系）含有Pi-ta抗病基因，反之，Pita引物不能檢測(cè)出1 042 bp的預(yù)期條帶，NPita引物能檢測(cè)出1 042 bp的預(yù)期條帶，則該品種（系）含有pi-ta感病基因（圖1-A、圖1-B、表2）：Pi-5由3對(duì)引物進(jìn)行檢測(cè)，在含有該抗性基因的品種（系）中，引物JJ80、JJ81、JJ113分別檢測(cè)出442 bp、343 bp、484 bp的預(yù)期條帶（圖1-C、圖1-D、圖1-E、表2）;Pi-km基因需Pi-kml和Pi-km2進(jìn)行檢測(cè)，Pi-kml檢測(cè)出174 bp的預(yù)期條帶，同時(shí)Pi-km2檢測(cè)出290 bp的預(yù)期條帶，說(shuō)明該品種（系）含有Pi-km抗病基因（圖1-F、圖1-G、表2）;Pib引物檢測(cè)出365 bp的預(yù)期條帶，同時(shí)NPib引物不能檢測(cè)出803 bp的預(yù)期條帶，則該品種（系）含有Pi-b抗病基因，反之，Pib引物不能檢測(cè)出365 bp的預(yù)期條帶，NPib引物能檢測(cè)出803bp的預(yù)期條帶，則該品種（系）含有pi-b感病基因（圖1-H、圖1-1、表2）。

2.2 Pi-ta、Pi-5、Pi-km和Pi-b在238份粳稻品種（系）中的區(qū)域分布

根據(jù)基因檢測(cè)結(jié)果，統(tǒng)計(jì)4個(gè)稻瘟病抗性基因在238份粳稻品種（系）中的分布。Pi-ta、Pi-km和Pi-b的分布頻率較高，分別為34.87%、30.25%和38.66%.而Pi-5較低，為21.43%。在區(qū)域分布上，Pi-ta和Pi-b集中于東北、長(zhǎng)江中下游及西南地區(qū)粳稻品種（系）中，而在西北地區(qū)粳稻品種（系）、日韓粳稻品種中的含有率較低。Pi-5和Pi-km在西南地區(qū)粳稻品種（系）中的分布頻率較高，分別為

2.3 不同抗性單基因及基因組合在粳稻品種（系）中的分布頻率

根據(jù)基因鑒定結(jié)果，238份粳稻品種（系）中僅含單個(gè)抗性基因的品種（系）有130份，所占比例為54. 62%，包括33、30、29和38份分別含Pi-ta、Pi-5、Pi-km和Pi-b基因的品種（系），所占比例分別為13.87%、12.61%、12.18%和15.97%。含2個(gè)抗性基因的品種（系）有66份，所占比例為27.73%。其中，含Pi-ta/Pi-b基因的品種（系）數(shù)最多，為28份，所占比例為11.76%：含Pi-km/Pi-b基因的品種（系）次之，有14份，所占比例為5.88%：其他雙基因組合Pi-ta/Pi-5、Pi-ta/Pi-km、Pi-5/Pi-km、Pi-5/Pi-b的出現(xiàn)頻率較低，分別為1.68%、3.36%、3.78%和1.26%。含3個(gè)抗性基因的品種（系）有12份，所占比例為5. 04%。其中，含Pi-ta/Pi-5/Pi-km基因的品種有3份，含Pi-ta/Pi-km/Pi-b基因的品種（系）有7份，含Pi-5/Pi-km/Pi-b基因的品種（系）有2份。沒(méi)有檢測(cè)到同時(shí)含4個(gè)抗性基因的品種（系）。4個(gè)抗性基因均不含的品種（系）有30份，所占比例為12.61%（表4）。

根據(jù)上述對(duì)粳稻品種（系）的6個(gè)區(qū)域劃分，分別統(tǒng)計(jì)了4個(gè)單基因及不同基因組合在不同地域的分布特點(diǎn)。長(zhǎng)江中下游地區(qū)167份粳稻品種（系）中僅含單基因的品種（系）有100份，所占比例為59. 88%，其中單基因頻率由高到低依次為Pi-b、Pi-ta、Pi-5、Pi-km，遠(yuǎn)高于含2個(gè)及以上抗性基因品種（系）的所占比例（28.14%）;47份含2個(gè)及以上基因的品種（系）中，頻率最高的是含Pi-ta/Pi-b雙基因的品種（系），高達(dá)25份，遠(yuǎn)高于含其他基因組合的品種（系），這可能與江蘇省粳稻育種中側(cè)重于Pi-ta和Pi-b組合的傾斜有關(guān)。與長(zhǎng)江中下游地區(qū)類似，西北和日韓地區(qū)粳稻品種（系）大多只含單個(gè)抗性基因，抗性基因主要為Pi-km.東北、華北和西南地區(qū)品種（系）大多同時(shí)含2個(gè)抗性基因。Pi-ta/Pi-5基因組合的品種（系）在東北地區(qū)的分布頻率最高，為14.29%，而在其他地區(qū)的品種（系）中幾乎無(wú)分布;Pi-ta/Pi-km在西南地區(qū)的品種（系）中分布頻率最高，為20.00%，遠(yuǎn)高于其他地區(qū);Pi-5/Pi-km，在華北和西南地區(qū)的品種（系）中分布頻率較其他地區(qū)高，分別為23.08%和20.00%。此外，Pi-km，/Pi-b在東北、西南和日韓地區(qū)的品種（系）中也具有較高的分布頻率，三基因組合Pi-ta/Pi-5/Pi-km，在貴州的畢粳44號(hào)、遼寧的中丹2號(hào)和江蘇的泗稻12號(hào)中檢測(cè)到（表4）。

2.4 不同抗性單基因及基因組合對(duì)穗頸瘟的抗性效果

利用江蘇省具有代表性的6個(gè)稻瘟病生理小種的混合菌液對(duì)238份粳稻品種（系）進(jìn)行穗頸瘟抗性的田間接種鑒定。33份僅含Pi-ta單基因的品種（系）均表現(xiàn)為抗病，且抗病水平顯著優(yōu)于其他抗病基因，感病率為0，病情指數(shù)22.73。30份僅含Pi-5單基因的品種（系）中，有11份表現(xiàn)為抗病，19份表現(xiàn)為感病，感病率為63.33%，病情指數(shù)59.17。29份只含Pi-km的品種（系）中，有10份表現(xiàn)為抗病，11份為感病，8份為高感，感病率為65.52%，病情指數(shù)為70.69。38份只含Pi-b的品種（系）中，有5份表現(xiàn)為抗病，13份表現(xiàn)為感病，20份表現(xiàn)為高感，感病率為86.84%，病情指數(shù)為83.55。

雙基因組合中，含Pi-ta/Pi-5和Pi-ta/Pi-km的品種（系）抗性效果最好，感病率均為0，病情指數(shù)分別為6.25和12.50.低于只含Pi-ta抗病基因品種（系）的病情指數(shù)：其次為含Pi-ta/Pi-b和Pi-5/Pi-km抗病基因的品種（系），感病率分別為0和11.11%，病情指數(shù)分別為27. 68和27. 78.遠(yuǎn)低于含Pi-b/Pi-5和Pi-b/Pi-km，的品種。三基因組合中，含Pi-ta/Pi-5/Pi-km的品種（系）抗性效果最好，其感病率和病情指數(shù)均為0，但品種數(shù)目較少，僅3份，后期仍需進(jìn)一步驗(yàn)證（表5）。另外，發(fā)現(xiàn)在30份不含上述4個(gè)抗性基因的品種（系）中，有4份表現(xiàn)出抗病性，說(shuō)明這些品種中可能還有其他的抗病基因。

3 討論

穗頸瘟一直是粳稻生產(chǎn)中的重要病害，在水稻孕穗期，病菌侵入穗部，阻礙養(yǎng)分輸送，形成枯枝、白穗，從而造成產(chǎn)量嚴(yán)重?fù)p失。目前，選育和推廣抗病品種是防止該病流行的有效手段。由于克隆的稻瘟病抗性基因數(shù)量較多且不同地區(qū)稻瘟病菌存在致病性的差異，因此，明確不同稻區(qū)具有針對(duì)性的基因或基因組合是決定抗病育種成敗的重要工作。Pi-ta、Pi-5、Pi-km，和Pi-b基因具有廣譜稻瘟病抗性，且近年來(lái)，Pi-ta/Pi-b作為江蘇省粳稻抗穗頸瘟育種的優(yōu)勢(shì)組合，在育種中被廣泛運(yùn)用。王軍等研究發(fā)現(xiàn)抗性基因Pi-ta、Pi-b與江蘇省粳稻穗頸瘟抗性呈正相關(guān)，同時(shí)攜帶這2個(gè)基因可大大提高品種的穗頸瘟抗性。然而，宋兆強(qiáng)等研究發(fā)現(xiàn)Pi-b/Pi54、Pi-b的抗性逐年喪失，且Pi-ta、Pi-ta/Pi-b的抗性有減弱趨勢(shì)。由此可見(jiàn)，加強(qiáng)挖掘Pi-ta/Pi-b的優(yōu)勢(shì)替代組合，擴(kuò)大有利抗性基因的滲入和聚合，避免抗性基因組合單一化，有利于江蘇省粳稻穗頸瘟抗性的維持和提高。

本研究利用稻瘟病抗性基因Pi-ta、Pi-5、Pi-km、Pi-b的功能標(biāo)記，對(duì)238份粳稻品種（系）的基因進(jìn)行檢測(cè).結(jié)合穗頸瘟抗性接種鑒定結(jié)果，明確這些抗性基因及基因組合在粳稻栽培品種（系）中的分布特點(diǎn)，以及對(duì)江蘇省粳稻穗頸瘟的抗性效果。238份粳稻品種（系）中4個(gè)抗性基因的分布存在明顯差異，其中，Pi-b的分布頻率最高，占供試總材料的38.66%，38份僅含有該基因的品種（系）中有33份表現(xiàn)感病，其中高感品種多達(dá)20份。而相對(duì)于Pi-b，僅含Pi-ta的33份品種（系）均表現(xiàn)為抗病性，其中9份的抗性等級(jí)為0級(jí)：含Pi-ta/Pi-b雙基因組合的品種（系）具有與僅含Pi-ta單基因品種（系）相同的抗病性。以前的研究者認(rèn)為，同時(shí)含Pi-ta、Pi-b基因的品種對(duì)穗頸瘟抗性優(yōu)于含單個(gè)基因的品種，這與本研究結(jié)果不一致，本研究中Pi-b基因表現(xiàn)出對(duì)穗頸瘟抗性的明顯喪失，可能與稻瘟病菌生理小種的變異有關(guān)。本研究中Pi-ta的抗性效果與前人報(bào)道類似，具有極好的穗頸瘟抗性的效果，該基因主要分布于長(zhǎng)江中下游省份特別是江蘇省的栽培粳稻中，而在其他地區(qū)則極少存在，說(shuō)明該基因可以進(jìn)一步的擴(kuò)大使用，特別是在稻瘟病高發(fā)的四川等地?？梢岳脤y帶Pi-ta基因的品種通過(guò)雜交和標(biāo)記輔助選擇方式，將目標(biāo)基因定向?qū)说礁胁∑贩N中，改良品種的抗性效果。

Pi-5與Pi-km同屬于含2個(gè)獨(dú)立的NBS-LRR類抗性基因，在抗性育種中亦具有較高的利用價(jià)值。王麗麗等研究發(fā)現(xiàn)，粳稻品種中聚合Pi-ta與Pi-5對(duì)遼寧稻區(qū)的稻瘟病抗性貢獻(xiàn)最大。閻勇等研究發(fā)現(xiàn)，含有Pi-ta/Pi-km雙基因的稻株較僅含Pi-ta基因的稻株表現(xiàn)更強(qiáng)的稻瘟病抗性。本研究中檢測(cè)到僅含Pi-5或Pi-km基因的粳稻品種（系）分別為30份和29份，病情指數(shù)分別為59.17和70.69，明顯優(yōu)于Pi-b基因的抗性水平（病情指數(shù)83. 55）。含Pi-5/Pi-km雙基因組合的9份品種中，僅有1份表現(xiàn)為感病，其抗病性明顯高于含其中任一個(gè)單基因的品種（系）。4份含Pi-ta/Pi-5和8份含Pi-ta/Pi-km雙基因的品種（系）均較含Pi-ta/Pi-b和Pi-ta基因的品種（系）具有更強(qiáng)的穗頸瘟抗性。3份含Pi-ta/P1-5/Pi-km，三基因組合的品種（系）均表現(xiàn)免疫，病情指數(shù)為0。這些結(jié)果說(shuō)明Pi-5和Pi-km，可能是穗頸瘟抗性的微效基因，且抗性效果具有累加作用。因此，在粳稻穗頸瘟抗性育種中，我們應(yīng)該使用多種抗性基因聚合的方式改良品種的抗性。根據(jù)本研究結(jié)果，可以將Pi-ta、Pi-5和Pi-km進(jìn)行同時(shí)聚合，培育出如畢粳44號(hào)（貴州）、中丹2號(hào)（遼寧）和泗稻12號(hào)（江蘇）對(duì)稻瘟病菌高度免疫的高抗品種，從而避免稻瘟病菌生理小種變異而帶來(lái)的潛在風(fēng)險(xiǎn)。