棉花蕾鈴離層脫落相關基因的克隆及其表達分析

張書芹

摘要：【目的】研究激素與棉花蕾鈴脫落的關系，為解析離層脫落相關基因的表達、調控及功能鑒定提供基礎資料。【方法】以50 mg/L赤霉素（GA3）和250 mg/L乙烯利（CEPA）分別處理的棉花蕾鈴離層cDNA為Tester，H2O處理的棉花蕾鈴離層cDNA為Driver，利用抑制消減雜交（SSH）技術構建經GA3和乙烯處理后的消減文庫，反向Northern blo-tting篩選出離層差異表達的EST序列，然后進行基因功能注釋與功能分類，并分析蕾鈴離層差異表達基因的組織表達模式和GA3誘導表達規(guī)律?！窘Y果】以GA3處理的離層cDNA為Tester、H2O處理的離層cDNA為Driver，所構建的cDNA文庫命名為GA文庫；以CEPA處理的離層cDNA為Tester、H2O處理的離層cDNA為Driver，所構建的cDNA文庫命名為CE文庫。從構建的兩個消減文庫（GA和CE）中共篩選出29個在離層差異表達的EST序列，通過基因功能注釋與功能分類，可將這些EST序列分為翻譯相關、代謝相關、信號傳導、轉錄相關、蛋白合成、能量代謝、抗逆相關、基因組序列和未知功能等九大類，其中與翻譯相關的EST序列占24.14%，說明經激素處理后棉花蕾鈴離層有大量的蛋白合成。從消減文庫中挑選10個差異表達基因（EST序列）進行RT-PCR分析，結果發(fā)現(xiàn)以GA3處理棉花蕾鈴離層后部分相關基因的表達模式會發(fā)生變化?！窘Y論】棉花蕾鈴離層經激素處理后能激活脫落相關基因的表達，進而影響器官脫落，是其對逆境脅迫反應的結果。

關鍵詞： 棉花蕾鈴；赤霉素；乙烯；離層；cDNA文庫；抑制消減雜交（SSH）

中圖分類號： S562 文獻標志碼：A 文章編號：2095-1191（2018）05-0832-07

Abstract：【Objective】The present study investigated the relationship between hormones and abscission of cotton boll to provide basic data on gene expression， regulation and function of abscission related genes. 【Method】The cDNA of boll abscission layers treated by 50 mg/L gibberellin solution（GA3） and 250 mg/L ethephon solution（CEPA） respectively was used as Tester， while cDNA prepared from abscission layers which were treated with H2O was used as Driver. Subtractive library treated with GA3 and CEPA was constructed by suppression subtractive hybridization（SSH） technology and the EST sequence differentially expressed in abscission layer was selected by reverse Northern blotting. Then gene function annotation and function classification were carried out. The tissue expression patterns and GA3 induced expression patterns of the differentially expressed genes in boll abscission layer were analyzed. 【Result】The Tester was the cDNA prepared from abscission layers treated with GA3， the Driver was the cDNA prepared from abscission layers treated with H2O. The constructed library was named GA library. The Tester was the cDNA prepared from abscission layers treated with CEPA， the Driver was the cDNA prepared from abscission layers treated with H2O. The constructed library was named GA library.Twenty-nine EST sequences differentially expressed in abscission layer were found in the two constructed subtractive libraries（GA and CE） by sequence analyzed. Through gene function annotation and function classification， the EST sequences were involved in translation， metabolism， signal transduction， transcription， protein synthesis， energy metabolism， stress defense， genome DNA and unknown function. The genes that related to translation accounted for 24.14%， which showed that there was a great deal of protein synthesis after hormonal treatment in abscission layer cells. Ten diffe-rentially expressed genes（EST sequence） from these libraries were analyzed by RT-PCR. It was found that the expression patterns of some genes changed after the cotton boll abscission layer was treated with GA3. 【Conclusion】After hormone treatment， the abscission layer of cotton boll can activate the expression of abscission-related genes， thus affecting the abscission of organs， which is the result of their response to adversity stress.

Key words： cotton boll； gibberellin； ethylene； abscission layer； cDNA library； suppression subtractive hybridization（SSH）

0 引言

【研究意義】棉花（Gossypium）是世界上最重要的經濟作物之一，棉纖維是紡織工業(yè)自然纖維的主要來源。在實際生產中，棉花蕾鈴脫落是非常普遍的現(xiàn)象，其脫落高峰在棉株盛花期后5～10 d，脫落率在60%～70%，高的可達80%。不同棉種其蕾鈴脫落率也不同，一般表現(xiàn)為陸地棉脫落率高于海島棉（張炎等，2012；鄧忠等，2017）。影響棉花蕾鈴脫落的因素較多，除了生理脫落因素外，生育期的灌溉與施肥策略也發(fā)揮著重要作用，因此，解析棉花蕾鈴脫落機制對提高棉花單位面積產量具有重要意義?！厩叭搜芯窟M展】乙烯在植物器官脫落過程中起促進作用（Tranbarger et al.，2017），如蘋果幼果脫落與乙烯含量上升密切相關（Yuan，2007；Zhu et al.，2011），而外源施用乙烯或乙烯利可促進植物器官脫落，采用乙烯處理玫瑰后其花瓣脫落率顯著升高（Singh et al.，2011），處理橄欖后其成熟果實脫落也顯著增加（Gil-Amado and Gomez-Jimenez，2012），采用2 mL/L乙烯利噴施龍眼果穗10 d內可造成62.46%的果實脫落（楊子琴等，2015），噴施1.80 g/L乙烯利2和4周后澳洲堅果的落果率分別達98.75%和100.00%（柳覲等，2017）。盡管現(xiàn)有的研究已表明乙烯濃度上升與植物器官脫落呈正相關，但乙烯濃度上升只是器官脫落的中間環(huán)節(jié)；因為只有促使乙烯合成才會引起離層細胞壁水解酶活性增強及相關基因表達量上升，離層細胞壁破碎，最終導致器官脫落（Roberts et al.，2002）。赤霉素（GA3）對植物器官脫落也有一定的調控作用。Bains等（1999）在芒果中研究發(fā)現(xiàn)，內源GA3含量不論是在脫落的果實還是果蒂中，均低于未脫落的果實和果蒂；Gómez-Cadenas等（2000）研究發(fā)現(xiàn)，脫落柑橘果實中的活性GA3含量較未脫落時約降低400%；孫穎等（2014）研究表明，噴施不同濃度的外源GA3均能抑制油桐花芽分化，其中以噴施200 mg/L的抑制效果最明顯；楊波等（2015）研究表明，新梢和幼果中對應內源激素間的濃度平衡關系是調控扁桃幼果生理脫落的重要因素，表現(xiàn)為幼果中高GA3和生長素（IAA）濃度、低脫落酸（ABA）濃度有利于扁桃坐果；李長江等（2017）研究發(fā)現(xiàn)，庫爾勒香梨萼片脫落與內源激素的分布密切相關，其中幼果萼端GA3的積累可能有利于果實萼片脫落?！颈狙芯壳腥朦c】目前，已有學者從離層相關基因方面研究揭示植物器官脫落的原理。Cho等（2008）研究發(fā)現(xiàn)，IDA、HSL2、HAE和MAPK激酶調控花器官離層的形成；Leslie等（2010）、Lewis等（2010）、Niederhuth等（2013）研究認為，類受體細胞質激酶負調控IDA/HAE信號蛋白，進而影響離層發(fā)育；常璟等（2015）從陸地棉中克隆獲得調控離層分化及形成相關的BOP基因；但至今鮮見針對棉花蕾鈴脫落的分子機制研究?！緮M解決的關鍵問題】以50 mg/L GA3和250 mg/L乙烯利分別處理的離層cDNA為Tester，H2O處理的棉花蕾鈴離層cDNA為Driver，利用抑制消減雜交（Suppression subtraction hybridization，SSH）技術構建經GA3和乙烯處理后的cDNA文庫，對獲得的離層差異表達EST序列進行基因功能注釋與功能分類，并分析離層差異表達基因的組織表達模式和GA3誘導表達規(guī)律，為解析離層脫落相關基因的表達、調控及功能鑒定提供基礎資料。

1 材料與方法

1. 1 試驗材料

供試材料為華中農業(yè)大學棉花試驗田種植的陸地棉（G. hirsutum）遺傳標準系TM-1，于棉蕾開花當天分別用50 mg/L GA3、250 mg/L乙烯利（CEPA）和H2O（CK）點涂其離層，并于點涂后0、1、2、4、8、12、24、48和72 h及5 d以刀片切取約0.5 cm的離層組織，經液氮速凍后置于-80 ℃超低溫冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1. 2 核酸提取及mRNA分離

采用改良的異硫氰酸胍法提取總RNA（Li et al.，2002），用1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測其質量，紫外分光光度計法測定其濃度和純度。取GA3、CEPA和H2O處理各時期的RNA分別等量混合，按照Oligotex mRNA Mini Kit試劑盒（德國QIAGEN公司）說明，從總RNA中分離純化出mRNA，以1.0%瓊脂糖凝膠電泳進行檢測。

1. 3 抑制消減文庫構建

以50 mg/L GA3處理的離層cDNA為Tester、H2O處理的離層cDNA為Driver，構建cDNA文庫GA；以250 mg/L CEPA處理的離層cDNA為Tester、H2O處理的離層cDNA為Driver，構建cDNA文庫CE。采用Clontech PCR-SelectTM cDNA Subtractive Kit試劑盒（美國BD公司）完成抑制消減雜交，對消減后的第二次PCR產物進行純化、連接并轉化大腸桿菌感受態(tài)細胞，經藍白斑篩選，即獲得消減文庫。

1. 4 消減文庫鑒定及序列分析

挑取陽性克隆接種到含有氨芐青霉素的LB液體培養(yǎng)基中，37 ℃培養(yǎng)過夜，取菌液進行PCR鑒定。然后挑選插入片段大于250 bp、帶型單一的PCR產物點制Microarray。將GA3、CEPA和H2O處理各時期的RNA等量混合，采用MLV Reverse Transcriptase（美國Promega公司）進行反轉錄，以1.00 μL的10 m Ci/mL[α-32P]-dCTP進行探針標記，經雜交、洗膜和磷屏成像，通過Array Gauge Version 1.0對信號值進行數(shù)字化轉換。選取雜交信號值變化明顯的克隆進行接菌培養(yǎng)及測序分析，測序結果去除載體和接頭序列，利用GenBank數(shù)據庫中的BLASTx分析對所獲得的EST序列進行功能分類。

1. 5 RT-PCR分析差異基因表達情況

對兩個消減文庫中差異表達的EST序列設計特異引物，以陸地棉TM-1的根、莖和葉及經GA3處理0.5、2.0、4.0、8.0和12.0 h的蕾鈴離層，共8個材料的cDNA為模板，進行PCR擴增。PCR反應體系20.00 ?L：10×Buffer 2.00 ?L、MgCl2（25 mmol/L）1.50 ?L、正、反向引物（10 μmol/L）各0.25 ?L、dNTP（10 mmol/L）0.40 ?L、稀釋后的反轉錄產物1.00 ?L、Taq DNA酶1 U、ddH2O補足至20.00 ?L。擴增程序：94 ℃預變性3 min；94 ℃ 30 s，54 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，進行35個循環(huán)；72 ℃延伸10 min。取8.00 ?L PCR擴增產物在1.2%瓊脂糖凝膠上進行電泳檢測。

2 結果與分析

2. 1 總RNA和mRNA質量檢測結果

GA3、CEPA和H2O處理各時期總RNA經1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測，發(fā)現(xiàn)28S、18S和5S條帶清晰，無明顯拖尾，且18S和28S兩條條帶明亮（圖1），說明總RNA完整性良好。所有樣品的OD260/OD280均在1.8以上，濃度超過1 ?g/?L，說明RNA純度高，符合建庫要求。采用Oligotex法分離mRNA，然后進行1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測，結果顯示3個材料的mRNA均無明顯28S和18S條帶，呈彌散狀（圖2），說明rRNA已剔除，mRNA完整性良好。

2. 2 抑制消減文庫構建情況

以GA3處理的離層cDNA為Tester、H2O處理的離層cDNA為Driver，構建的文庫命名為GA文庫；以CEPA處理的離層cDNA為Tester、H2O處理的離層cDNA為Driver，構建的cDNA文庫命名為CE文庫。經第二輪PCR擴增后，凝膠電泳檢測顯示兩個文庫消減后的產物均呈彌散狀分布，無明顯主帶，分子量大小為250～1000 bp，平均在500 bp左右（圖3），符合對文庫裝載片段大小的要求。

2. 3 消減文庫的PCR鑒定及反向Northern blotting篩選結果

第二輪PCR產物經連接和轉化后，挑選長勢較好的白色菌落使用SP6和T7通用引物進行菌液PCR鑒定，瓊脂糖凝膠電泳檢測結果顯示，插入片段分子量范圍在200～1000 bp，平均在500 bp左右。說明插入片段呈隨機分布，擴增效率好。部分克隆的PCR擴增電泳結果見圖4，反向Northern blotting篩選結果見圖5。

2. 4 EST同源性分析結果

從GA文庫中選取雜交信號比值大于3或小于1/3的克隆97個，從CE文庫中選取雜交信號比值大于3或小于1/3的克隆11個進行測序分析，去除重復序列和低質量序列后，從GA文庫中共獲得68條高質量的EST序列，從CE文庫中共獲得11條高質量的EST序列。對獲得的EST序列先以TBLASTx進行注釋比較，然后用ClustalX對同一基因的不同片段合并后，文庫GA有25條EST序列，文庫CE有4條EST序列，共產生29條EST序列。這29條EST序列中來自擬南芥的有11條，來自棉花的有6條，其余的來自其他物種。

為進一步了解這些EST序列的功能，參照Bevan等（1998）、Mahalingam等（2003）的方法對其功能進行分類，結果發(fā)現(xiàn)篩選出的29條EST序列可分為翻譯相關、代謝相關、信號傳導、轉錄相關、蛋白合成、能量代謝、抗逆相關、基因組序列和未知功能九大類（表1）。其中，與翻譯相關的EST序列占24.14%，與信號傳導、代謝相關和轉錄相關的EST序列各占13.79%，與能量代謝相關的EST序列占10.35%，與蛋白合成、抗逆相關和基因組序列相關的EST序列各占6.90%，未知功能的EST序列占3.45%。

2. 5 RT-PCR分析結果

從消減文庫中挑選10個差異表達基因（EST序列）進行RT-PCR，分析其在陸地棉TM-1根、莖、葉及經GA3處理蕾鈴離層中的誘導表達模式。結果（圖6）表明，查耳酮合酶（Chalcone synthase）基因在根、莖、葉中均有表達，GA3誘導2.0 h后其在蕾鈴離層中的表達量最高。脫氫抗壞血酸還原酶（Dehydroascorbate reductase）基因在各組織均有表達，但在蕾鈴離層中的表達量明顯高于其他組織。肽基脯氨?；樂串悩嬅福≒eptidyl-prolyl cis-trans isomerase）基因在根和莖中表達量很高，在葉和GA3誘導蕾鈴離層中表達較弱，經GA3誘導2.0 h后幾乎不表達。甘油醛-3-磷酸脫氫酶（Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase）基因在各組織均有表達，GA3誘導2.0和8.0 h后的表達量最高。纖維蛋白（Fiber protein）基因在根和葉中表達很弱，在莖和蕾鈴離層中的表達強度一般。翻譯調節(jié)腫瘤蛋白（Translationally controlled tumor protein）基因在根和莖中表達量非常高，在葉中幾乎不表達，GA3誘導0.5 h后在蕾鈴離層中微弱表達，誘導12.0 h后表達量達最高值。GA-2-A23在根、莖、葉和蕾鈴離層中表達量均較高；CE-1-K17需在GA3誘導4.0～12.0 h后才表達，以誘導4.0 h的表達量最高，然后逐漸下降；GA-1-L22在根、莖和葉中均不表達，經GA3誘導后呈微弱的表達；GA-2-N8在莖和葉中均不表達，在根和GA3誘導蕾鈴離層中的表達量也較低?？梢?，以GA3處理蕾鈴離層后部分基因的表達模式會發(fā)生變化。

3 討論

SSH技術是以兩輪消減雜交和兩次PCR擴增為核心，致使差異表達的基因片段大量富集，具有假陽性低、靈敏度高、篩選效率高、操作簡單、周期短等優(yōu)點（周變華等，2011；蔣小珍等，2014；樊瑩和董霞，2015）。目前，利用SSH技術已分離獲得棉花體細胞胚發(fā)生過程中的相關基因（Zeng et al.，2006）、原生質體培養(yǎng)棉花細胞壁再生相關基因（Yang et al.，2008）及棉花受黃萎病菌誘導表達的差異基因（Xu et al.，2011）等。本研究采用SSH技術構建棉花蕾鈴離層經GA3、乙烯處理后的cDNA文庫，并從構建的兩個消減文庫（GA和CE）中篩選出29個在離層差異表達的EST序列，通過基因功能注釋與功能分類，可將這些EST序列分為翻譯相關、代謝相關、信號傳導、轉錄相關、蛋白合成、能量代謝、抗逆相關、基因組序列和未知功能等九大類。其中，與翻譯相關的EST序列占24.14%，與信號傳導、代謝相關和轉錄相關的EST序列各占13.79%，與能量代謝相關的EST序列占10.35%，與蛋白合成、抗逆相關和基因組序列相關的EST序列各占6.90%，未知功能的EST序列占3.45%。該結論為進一步研究棉花蕾鈴脫落機制提供了基礎資料。

本研究采用GA3和乙烯利處理棉花蕾鈴離層，構建了兩個消減文庫（GA和CE），測序分析和序列注釋分析結果表明大部分基因是核糖體基因，可能是蛋白質大量翻譯造成核糖體基因富集，也說明經激素處理后激活了大量基因的轉錄和翻譯。其中，翻譯調節(jié)腫瘤蛋白在物種間高度保守，并具有多種生物學功能。Lopez和Franco（2006）首次從草莓果實中克隆獲得翻譯調節(jié)腫瘤蛋白基因，且發(fā)現(xiàn)隨著果實的成熟其表達量逐漸增加。陳科等（2012）研究表明，翻譯調節(jié)腫瘤蛋白可調節(jié)細胞骨架的動態(tài)變化及細胞生長與增殖，能夠激活干細胞標記基因Oct4和Nanog的轉錄；調節(jié)細胞凋亡、腫瘤逆轉、細胞分化、炎癥反應及保護細胞免受各種應激的損傷。本研究結果表明，翻譯調節(jié)腫瘤蛋白基因在陸地棉的根、莖和經GA3誘導蕾鈴離層中呈上調表達，且在GA3誘導12.0 h后表達量達峰值。肽基脯氨?；樂串悩嬅富蚺c植物響應逆境有關（Romano et al.，2004）。本研究從GA3處理的GA文庫中也克隆出該基因，但在葉和GA3誘導蕾鈴離層中表達較弱，尤其是經GA3誘導2.0 h后幾乎不表達，說明其表達與GA3誘導處理有關。查耳酮合酶是類黃酮類物質生物合成途徑中的關鍵酶，是廣泛存在于高等植物中的次生代謝物，在植物花色素形成及抗蟲、抗病方面發(fā)揮重要作用（楊繼和顧紅雅，2006）。在本研究中，查耳酮合酶基因在根、莖、葉中均有表達，經GA3誘導2.0 h后其在蕾鈴離層中的表達量最高?？梢姡藁ɡ兮忞x層經激素處理后能激活脫落相關基因的表達，進而影響器官脫落，是其對逆境脅迫反應的結果。

4 結論

棉花蕾鈴離層經激素處理后能激活脫落相關基因的表達，進而影響器官脫落，是其對逆境脅迫反應的結果。該結論為進一步研究棉花蕾鈴脫落機制提供了基礎資料。

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（責任編輯 蘭宗寶）