舟山新木姜子揮發(fā)性成分的季節(jié)性變化及抑菌、抗氧化效果研究

李娜 李鑫 祝子坪 吳晗 傅蓉 陳瑋瑋

摘要： 對舟山新木姜子材料不同時期的葉片揮發(fā)性成分含量進行分析，研究其不同季節(jié)揮發(fā)性成分含量的動態(tài)變化以及揮發(fā)油的抑菌和抗氧化效果。結(jié)果表明：夏季揮發(fā)油含量最高為5.4%，精油的主要揮發(fā)性成分是酯類、單萜和倍半萜。抑菌性實驗結(jié)果表明精油具有抑菌效果，且效果隨著濃度的升高而增大。抗氧化性實驗通過DPPH自由基清除實驗表明舟山新木姜子精油精油具有較強的抗氧化性。

關(guān)鍵詞： 舟山新木姜子； 抑菌性； 抗氧化性； 成分變化

中圖分類號： S 759. 82， S788. 1 文獻標(biāo)識碼： C

舟山新木姜子（Neolitsea sericea）是普陀樟系樟科（Lauraceae）樟屬（Cinnamomum）常綠喬木，間斷生長在中國東部沿海地區(qū)，從上海金山縣大金山島向西坡延伸至浙江舟山群島和臺州等地，中國臺灣、朝鮮、日本也有生長，是常見于海拔200～400 m的低山溝谷常綠闊葉林的植物[ 2 - 3 ]。舟山新木姜子的數(shù)量很少，是荷蘭植物學(xué)家布魯曼（Blume）于 1826 年在舟山采到模式標(biāo)本后發(fā)表公布于世的，是我國唯一以舟山地名命名的植物[ 4 - 5 ]，在《中國珍稀瀕危保護植物名錄》第1冊中被列為二級保護對象。有學(xué)者研究，很多種新木姜子有引起血管收縮，抗腫瘤活性，抑菌活性等作用[ 4 ]。但目前對舟山新木姜子的研究主要集中在引種馴化、資源調(diào)查、群落結(jié)構(gòu)分析等方面，對其生物活性成分的研究較少。本文通過對舟山新木姜子葉片精油的成分及功能研究，分析其開發(fā)和利用價值，以期達到促進人工種植，保存物種的目的。

1 材料與方法

1. 1 儀器及材料

大腸桿菌（Escherichia coli）由臺州學(xué)院微生物實驗室提供。舟山新木姜子葉子采樣地點位于舟山市農(nóng)林局，位于中國大陸海岸線的中部，長江和錢塘江的入口處。用于成分分析的葉子分別在1、4、8、11月份在3株10～15年的舟山新木姜子樹上進行采摘，采摘部位靠近地面1.3～1.8 m的樹枝，靠近本年新生葉片上50 cm內(nèi)的葉片。采摘之后的葉子置于-80 ℃的冰箱中冷凍保存。

氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀（美國Agilen，7890A-

5975C）；精油提取器、恒溫培養(yǎng)箱（寧波江南儀器廠，GNP-9050）；全溫培養(yǎng)搖床（寧波江南儀器廠，QYC-200）；潔凈工作臺（蘇州安泰空氣技術(shù)有限公，VD-650-U）電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱（寧波江南儀器廠，DHG-9240AS ）。

阿莫西林膠囊（廣州白云山制藥總廠），其他試劑均為分析純，水為超純水。

1. 2 實驗方法

1. 2. 1 舟山新木姜子精油的提取

取180 g新鮮舟山新木姜子葉清洗干凈；加入打漿機中加水至500 mL，打漿20～30 min，取出；加入5 mL乙酸丁酯和5 g氯化鈉，充分?jǐn)嚢?，放入水蒸氣蒸餾裝置，靜置30 min；190 ℃，加熱蒸餾60～90 min；收集上層餾出液，多次提取之后一起置于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器，50 ℃，去除乙酸丁酯，蒸餾至原來的1/4的量，即得到以舟山新木姜子為主要成分的精油。利用蒸餾萃取法裝置在一定條件下分別提取舟山新木姜子精油。鮮葉稱重后置于烘干箱，干燥至恒重，并計算含水率。揮發(fā)油提取率計算公式：

揮發(fā)油提取率=×100%

1. 2. 2 舟山新木姜子精油的成分

色譜條件 GC 分析條件： 使用30 m×0. 25 mm×0.25 μm厚涂層的DB-5MS 石英毛細管柱， 柱溫以6 ℃ / min的速度由60 ℃升至300 ℃， 并保持2 min，汽化室溫度320 ℃ ， 柱前壓10 Pa，以高純氦作為載氣，進樣量1 μL，分流比50∶1。

MS 分析條件 電子轟擊源（EI） ，電子轟擊電壓70 eV，離子源溫度250 ℃， 倍增電壓1 294 V，質(zhì)量掃描范圍50～700 AMU。所得的質(zhì)譜圖直接與該機中NIST08質(zhì)譜庫檢索并參考相關(guān)文獻來比較確定。

1. 2. 3 舟山新木姜子精油抑菌實驗

（1）培養(yǎng)基的制備

配制牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基待用。

（2）菌懸液的制備

配置250 mL的牛肉膏培養(yǎng)液，滅菌，加入一環(huán)大腸桿菌，在搖床里37 ℃條件下培養(yǎng)24 h。

（3）濾紙片擴散法測定抑菌圈

將待測菌懸液各取1.0 mL均勻涂布于相應(yīng)的固體培養(yǎng)基表面，制成含菌平板。將濾紙用打孔器打孔，制成小圓片，滅菌。在無菌操作臺上，取250 uL精油潤濕6疊小紙片（孔徑6 mm，兩張小紙片為一疊，下同）5 min，將小紙片貼在培養(yǎng)基上，標(biāo)記為A；取125 uL精油、125 uL乙酸正丁酯潤濕6疊小紙片5 min，將小紙片貼在培養(yǎng)基上，標(biāo)記為B；取250uL乙酸正丁脂潤濕6疊小紙片5min，將小紙片貼在培養(yǎng)基上，作為陰性對照。然后將阿莫西林膠囊的粉末0.25 mg，稀釋于500 mL的無菌蒸餾水中，取250 uL潤濕6疊小紙片5 min，將小紙片貼在培養(yǎng)基上，作為陽性對照；取一個培養(yǎng)基，不放小紙片，標(biāo)記為E，作為空白對照。每組重復(fù)3次，然后按照順序?qū)⑦@些培養(yǎng)基放入恒溫培養(yǎng)箱37 ℃培養(yǎng)24 h。

（4）舟山新木姜子精油抗氧化活性測定DPPH法

通過DPPH自由基清除率表現(xiàn)舟山新木姜子精油的抗氧化活性。取DPPH（1，1-二苯基-2-三硝基苯肼）3.9 g，用無水乙醇定容到10 mL，取其中2～

100 mL容量瓶中定容到100 mL，得0.01 mmol/L的DPPH溶液，避光保存。取4 mL舟山新木姜子溶液、4 mL DPPH溶液、2 mL無水乙醇混合后，取1 mL測其在波長517 nm波長的吸光度值，記為Ai；取4 mL舟山新木姜子溶液、4 mL DPPH溶液、2 mL無水乙醇混合閉關(guān)反應(yīng)30 min后，取1 mL測其在波長517 nm波長的吸光度值，記為Aj；對照組為4 mL乙酸丁酯溶液、4 mL DPPH溶液、2 mL無水乙醇混合后，取1 mL測其在波長517 nm波長的吸光度值，記為Ac。

清除率：K=[1-（Ai-Aj）/Ac]×100%

1. 3 數(shù)據(jù)處理

試驗結(jié)果采用Microsoft Excel 2007 和SPSS17.0 軟件進行分析。

2 結(jié)果與分析

2. 1 舟山新木姜子葉片精油提取率的季節(jié)變化

舟山新木姜子葉片揮發(fā)油的含量隨不同季節(jié)發(fā)生變化，由圖1可見，8月時揮發(fā)油含量最高為5.4%；11月最低為3.6 %；4月和8月分別為 4.7%、5.3%。其中8月和11月?lián)]發(fā)油含量差異不顯著，與其他季節(jié)的揮發(fā)油含量差異均達到顯著水平。說明舟山新木姜子葉片精油的含量隨生理代謝的旺盛而增加。

2. 2 舟山新木姜子揮發(fā)油組分分析與比較

精油共檢測出24種揮發(fā)性成分，春季、夏季、秋季、冬季舟山新木姜子葉子揮發(fā)油，分別鑒定出 18、18、17、16種化合物，總含量占精油總成分60%～80%，一部分成分因為與數(shù)據(jù)庫圖譜匹配度低于80%，因此未做出鑒定。主要成分為單萜類、倍半萜和酯類。

從表1可以看出，不同季節(jié)舟山新木姜子葉子精油中的成分以脂類、單萜、倍半萜等為主。大部分揮發(fā)性成分在一年四季沒有特別大的變化，除了α蒎烯和呋喃型倍半萜甲酯。酯類物質(zhì)的含量在夏天最多，秋冬相對較少，丙酸丁酯和乙酸丁酯含量相對較高（圖2）。單萜類物質(zhì)的含量春天最多，夏天最少，α蒎烯只有春天才有，且含量很高，秋季羅勒烯含量很高。倍半萜類物質(zhì)的含量四季差異不大，桉油烯醇和呋喃型倍半萜甲酯含量較高，秋季呋喃型倍半萜甲酯含量升高，其他倍半萜類物質(zhì)均有下降?？梢娭凵叫履窘泳蛢?nèi)化合物種類以及含量隨季節(jié)變化明顯。

2. 3 舟山新木姜子葉片精油的抑菌效果

通過對大腸桿菌進行濾紙擴散法可以比較出舟山新木姜子精油是否抑制大腸桿菌的生長。從圖3中可以看出舟山新木姜子精油對大腸桿菌的生長有較強的抑制作用，隨著濃度的增加，抑菌效果增強。推測其抑菌成分主要為萜醇類物質(zhì)。

2. 4 舟山新木姜子葉片精油抗氧化性

舟山新木姜子揮發(fā)性成分具有清除DPPH自由基作用，具有抗氧化效果。由表2可以看出，乙酸丁酯為提取溶劑，無清除DPPH能力，舟山新木姜子精油具有較強的清除DPPH能力，但略低于VE?？寡趸镏饕ㄟ^兩種機制清除自由基的機制為氫原子轉(zhuǎn)移（HAT）和電子轉(zhuǎn)移（SET）[ 6 - 7 ]，推測舟山新木姜子葉片揮發(fā)油的抗氧化性是因含有大量的烯萜類成分具有這兩種功能。

3 結(jié)果與結(jié)論

通過體外實驗對舟山新木姜子精油的成分分析、抑菌性和抗氧化性進行了初步研究。利用水蒸氣有機溶劑蒸餾法獲得精油，用氣相色譜-質(zhì)譜數(shù)據(jù)系統(tǒng)（GC/MS），進行了分析精油被定性檢出化合物24種，主要是酯類、單萜和倍半萜。這些成分中大部分一年四季的變化不大，一般都是在春夏的含量提高，α蒎烯只在春季存在，且含量高，呋喃型倍半萜甲酯的含量在秋季升高了1倍左右。另外，不同季節(jié)舟山新木姜子揮發(fā)油的提取率存在差異，夏季最高為5.4%，冬季最低為3.7%，春季和秋季則分別為4.7%、5.3%。同時，精油對大腸桿菌由很強的抑制活性的作用，且濃度越高抑制效果越明顯。在抗氧化性實驗中，我們也發(fā)現(xiàn)舟山新木姜子精油具有很強的抗氧化作用。從以上結(jié)果來看不同季節(jié)精油的揮發(fā)性成分有所不同，可能抑菌性和抗氧化效果也存在不同，可以在用不同季節(jié)的精油進行深層的實驗，為進一步的開發(fā)利用奠定基礎(chǔ)。本實驗只做了大腸桿菌的抑菌實驗，接下來可以擴大菌種范圍，做其他菌種的抑菌實驗。從結(jié)論得出舟山新木姜子精油具有開發(fā)成為食品和化妝品天然抗氧化劑及抗菌劑的潛力，但是還需要做進一步實驗確定對人體是否無害。

參考文獻

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第1作者簡介： 李娜（1978-）， 女， 副教授， 主要從事天然產(chǎn)物的分離提取研究工作。

收稿日期： 2018 - 07 - 20

（責(zé)任編輯： 張亞楠）