植物原生質體融合方法的研究進展

李琦

摘 要：原生質體融合（protoplast fusion）是指通過物理或化學方法使兩個細胞的原生質體進行融合，經(jīng)培養(yǎng)獲得具有雙親全部或部分遺傳物質后代的方法。應用植物原生質體融合技術，可以克服遠緣雜交不親和的障礙，打破物種之間的生殖隔離，擴大雜交親本范圍，實現(xiàn)基因在物種間的轉移和遺傳重組，培育新品種和創(chuàng)造新物種。主要就植物原生質體融合的方法進行了闡述。

關鍵詞：植物原生質體；融合方法；研究進展

文章編號： 1005-2690（2018）06-0038-02 中圖分類號： Q943 文獻標志碼： A

原生質體是組成細胞的一個形態(tài)結構單位，原生質體是指被去掉了細胞壁后的被細胞膜包圍的“裸露細胞”，是開展基礎研究的主要材料。1960年英國科學家Cocking第一次用酶法大量制備原生質體，Cocking采用的方法是在番茄幼苗的根組織中加入可降解細胞壁的等滲酶液，在一定條件下培養(yǎng)一段時間后，發(fā)現(xiàn)大部分細胞的細胞壁被降解，從而制備出大量有活力的原生質體。

1 原生質體融合的目的及意義

原生質體融合技術可克服不同原生質體間的排斥力，使兩種不同種屬的原生質體間發(fā)生膜融合、胞質融合和核融合，進而形成具有含兩種遺傳物質的雜交細胞，克服遠緣雜交的不親和性和子代不育等障礙。另外，可轉移優(yōu)良的生物性狀，實現(xiàn)基因重組，而改良現(xiàn)有品種。目前原生質體融合所改良的目標性狀包括抗凍、抗干旱、抗病毒、抗蟲、耐高鹽等，還可按照人們預先的期望創(chuàng)造出新物種。

2 原生質體的融合方法

2.1 自發(fā)融合

在酶解細胞壁形成原生質體的過程中，相鄰的原生質體會因細胞間胞間連絲的擴展和粘連而彼此融合形成同核體（homokaryon）。每個同核體內可包含兩個或多個核，這種類型原生質體的融合被稱作為自發(fā)融合。多核融合體常出現(xiàn)在植物幼嫩葉片或分裂旺盛的培養(yǎng)細胞制備的原生質體中。如在玉米胚乳愈傷組織細胞和玉米胚懸浮細胞原生質體中，大約有50%是多核融合體。

2.2 高pH-高Ca2+法

通常情況下，Ca2+影響細胞融合的效率比Na+和K+ 要低，但是在高pH環(huán)境下，高濃度的Ca2+影響細胞融合的效率大大升高。該法以鈣鹽作誘導劑，在高Ca2+高pH的條件下，使原生質體發(fā)生融合。該種方法在1973年是由Keller和Melchers進行誘導煙草原生質體融合時創(chuàng)造的。具體是將兩個原生質體的混合物放于含有7.35 g/L CaCl2·2H2O和72.87 g/L甘露醇的溶液中，pH值為10.5，在200 rpm/min低速下離心3 min，然后將離心管保持在37 ℃水浴鍋中40～50 min。但這種方法僅適合葉肉原生質體的融合，并且要注意高pH環(huán)境對某些細胞生理活性產生的影響。

2.3 聚乙二醇（PEG）法

PEG是一種大分子量的水溶性多聚化合物。采用PEG法，需將兩種不同的原生質體以合適比例混合后，加入28%～58%的PEG溶液處理15～30 min，然后用培養(yǎng)基進行清洗后即可培養(yǎng)。后來有學者對PEG法進行了改進，即逐步降低PEG的濃度，提高溶液中Ca2+的濃度和pH值，使融合效果得到有效的提高。由于該法易于控制、操作簡單、促進細胞融合的能力較強、誘導的融合沒有特異性，故被廣泛選用。

2.4 電融合法

電融合法是指用細胞融合儀產生交變電壓和高壓脈沖電場，使粘連的原生質體膜瞬間破裂，然后與相鄰的不同原生質體連接閉合產生融合體。黃家總等成功地利用電擊細胞融合，使紫羅蘭和桂竹香的原生質體融合。該種方法的優(yōu)點是沒有化學殘留、對細胞的毒害作用較小、操作簡單、融合率高、一次可融合大量原生質體。

2.5 激光微束穿刺法

激光微束穿刺法是利用聚焦到微米級的激光微束對組織進行穿刺，引起細胞膜的可逆性穿孔，從而導入外源DNA的一種基因直接轉化方法。侯丙凱等首次用激光微束穿刺法照射油菜子葉葉柄，將殺蟲蛋白基因導入油菜，經(jīng)植物再生和卡那霉素篩選，成功獲得了抗蟲轉基因植株。此法對細胞的損傷較小，并且可以準確定位于被照射的細胞，但是因設備昂貴，故在大量培養(yǎng)生產中使用較少。

2.6 亞原生質體融合

植物亞原生質體主要包括3種，分別是核質體、胞質體和微原生質體，其中最常用的是胞質體和微原生質體。胞質體-原生質體融合被認為是獲得胞質雜種、轉移胞質因子最為有效的方法。如Sigareva等將大白菜原生質體與抗寒且具有Ogura型CMS特性的花椰菜胞質體融合，獲得的胞質雜種具有抗寒與胞質雄性不育的特性，與傳統(tǒng)方法相比，此法育種過程較短，生產效率更高。另外，微原生質體-原生質體融合也被稱為微核技術，是指將供體原生質體經(jīng)處理后僅含有一條或幾條染色體，用膜包被后與另一完整原生質體融合的技術。Ramulu等利用該技術在茄科不同屬植物間完成了目標染色體的轉移，并成功獲得植株。該技術雖可在不同種屬間轉移一條或多條染色體，并獲得性狀穩(wěn)定的再生植株，但制備微原生質體的難度較大，因此該技術在實際應用中具有一定的局限性。

3 展望

除上述植物原生質體融合方法外，還包括植物介導的遺傳轉化法、鹽類融合法、多聚化合物法、PEG-高Ca2+-高pH融合法，目前發(fā)展的如高通量細胞融合芯片方法和基于微流控芯片進行融合法。關于對植物原生質體融合方法的研究，是許多學者的研究對象，相信將來如果在原生質體融合效率和成本控制、多個原生質體間的融合與如何將優(yōu)良性狀基因精準地導入植物細胞融合方面取得進展，植物原生質體融合會起到更加重要的作用，創(chuàng)造更大的價值。

（收稿日期：2018-05-08）