七種風鈴草屬植物親緣關系的ISSR分析

包志遠 曲繼鵬 楊在君 路璐 廖明莉 周夢霞 彭正松

摘 要：為了解四川風鈴草屬植物的資源豐富度和遺傳進化情況，該研究利用ISSR分子標記，探究了四川7種風鈴草屬植物的親緣關系，為風鈴草屬植物的分子標記輔助鑒定、資源保護、花卉品種的開發(fā)與育種提供理論基礎。結果表明：40條ISSR引物中有28條引物能夠擴增出清晰的條帶，擴增總條帶數(shù)為164，其中有98.8%的擴增條帶具有多態(tài)性，供試的7種風鈴草屬植物遺傳相似性系數(shù)在0.421～0.945之間，其中鉆裂風鈴草與藏滇風鈴草的遺傳相似度最高為0.945，說明它們之間的親緣關系很近。此外，ISSR分子標記聚類結果表明，7種風鈴草屬植物可以明顯聚為4大類：西南風鈴草、灰毛風鈴草、灰?guī)r風鈴草為一類；紫斑風鈴草與流石風鈴草各成一類，這兩種在形態(tài)上與其它各種風鈴草差異較大；最后是鉆裂風鈴草與藏滇風鈴草為一類。

關鍵詞：風鈴草屬，ISSR分子標記，遺傳多樣性

中圖分類號：S688

文獻標識碼：A

文章編號：10003142（2018）06081807

Abstract： Genetic relationships among seven species in Campanula L. were investigated by intersimple sequence repeat molecular markers （ISSR）. The results showed that 28 of 40 primers can be amplified to clear bands. All the 28 ISSR primers amplified 164 bands，and the proportion of polymorphic fragment was 98.8%. The value of genetic similarity （GS） indexes of seven species based on the ISSR data varied from 0.421 to 0.945，and the highest genetic similarity was 0.945 between C. aristata and C. modesta，which indicated that they had closely relative relationship. Cluster analysis showed that all the species could be divided into four groups：C. colorata，C. cana and C. calcicola in the first group，C. calcicola in the second group，C. crenulata in the third group，and C. aristata and C. modesta in the last group. This study provides reference for the molecular marker assisted identification，resource conservation，flower variety development and breeding of Campanula.

Key words： Campanula L.，ISSR molecular marker，genetic diversity

風鈴草屬（Campanula L.），是桔?？浦参镏蟹N類最多的一個屬，包含了一年生植物和多年生植物共580～600種，主要分布于北半球，其中以地中海流域作為主要分布點（Sáez & Aldasoro，2003）。中國分布有19種，主要分布于西南山區(qū)（四川植物志編輯委員會，1999； 中國植物志編輯委員會，1990）。風鈴草屬植物的花冠似鈴鐺，花單生或多朵組成聚傘花序，花瓣5枚，瓣大，顏色大多呈現(xiàn)藍紫色或藍色，可作為觀賞類花卉應用于園林景觀。目前對于風鈴草屬植物的研究主要集中在物種的鑒定及分類（Birol，2004； Yildirim & Senol，2014）、自交不親和（GoodAvila et al，2008； GoodAvila & Stephenson，2003； Caser et al，2010）和傳粉機制等方面（Schlindwein et al，2005； Paulo et al，2015）。關于風鈴草屬植物親緣關系的研究至今尚未見報道。而開展風鈴草屬植物親緣關系的研究對該屬植物的鑒定、園林花卉品種的選育和雜交育種等工作具有重要的意義。

ISSR（intersimple sequence repeat），即簡單序列重復區(qū)間擴增，是1994年由Zietkiewicz et al（1994）創(chuàng)建的一種分子標記技術，現(xiàn)已廣泛應用于植物研究中。ISSR的基本原理就是以短重復序列（simple sequence repeat，SSR）為引物，來擴增兩個序列相同但方向相反微衛(wèi)星重復序列之間的DNA片段（劉君等，2012； 盧家仕等，2013； Phong et al，2011）。ISSR引物設計不需要像SSR那樣需要預先獲知基因組序列，而是通過在SSR的3′或5′端錨定1～4個隨機簡并核苷酸作為引物。相對于其它分子標記而言，ISSR分子標記操作簡單、快捷，同時兼?zhèn)銩FLP、SSR和RAPD等分子標記方法的優(yōu)點（Lisek & Rozpara，2010； Sharma et al，2015； Jabbarzadeh et al，2013）。ISSR標記以其高多態(tài)性，已被廣泛應用于遺傳多樣性、親緣關系、系統(tǒng)進化以及SSR引物開發(fā)等方面的研究（Wang et al，2013； 王惠梅等，2015）。本研究利用ISSR分子標記技術對分布于四川的7種風鈴草植物的親緣關系進行了研究，旨在了解四川風鈴草屬植物的資源豐富度和遺傳進化情況，為風鈴草屬植物的分子標記輔助鑒定、資源保護、花卉品種的開發(fā)與育種提供理論基礎和參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

2016年6—8月，分別在四川風鈴草屬植物的主要分布區(qū)康定、稻城、鄉(xiāng)城和城口等地采集了7種風鈴草屬植物。每個物種隨機選取20個個體的新鮮葉片混合，硅膠迅速干燥后保存?zhèn)溆?。實驗材料的具體信息如表1所示。

1.2 方法

1.2.1 7種風鈴草植物DNA的提取 利用多糖多酚植物DNA提取試劑盒（鐘鼎生物，江蘇）分別提取7種風鈴草葉片的基因組DNA。具體操作參考試劑盒的說明書進行。DNA的質量和完整性用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測，用NanoDrop2000微量紫外分光光度計檢測DNA的純度和濃度。提取的DNA儲存在-20 ℃冰箱中備用。

1.2.2 PCR反應體系建立及引物篩選 選取40條ISSR引物序列，引物由上海生工生物工程（上海）股份有限公司合成。PCR反應總體系為10 μL，包括5 μL 2×TaqPCR MasterMix（TIANGEN，北京）；3 μL ddH2O；1 μL（10 ng·μL1）引物；1 μL基因組DNA。PCR的擴增程序：94 ℃預變性5 min；94 ℃變性30 s，40～70 ℃ （退火溫度根據(jù)具體引物而定）退火30 s，72 ℃延伸1 min，總共45個循環(huán)；循環(huán)完成后72 ℃繼續(xù)延伸5 min，最后4 ℃保存。并用1.5%的瓊脂糖凝膠電泳對PCR的擴增產物進行檢測，用凝膠成像系統(tǒng)拍照并保存圖片。

1.2.3 數(shù)據(jù)的統(tǒng)計與分析 根據(jù)凝膠成像系統(tǒng)成像的結果，在圖譜同一位置上有電泳條帶的賦值為1，反之為0，最終的統(tǒng)計結果表現(xiàn)為0和1的矩陣圖。利用Anderson et al（1993）方法計算出PIC的值，即多態(tài)性信息量（polymorphism information content，PIC）。計算公式：

式中，Pij表示標記i的第j個帶型出現(xiàn)的頻率，PIC值的大小與多態(tài)性的高低密切相關，PIC值越大，表明多態(tài)性越高，其最大值為1，最小值為0。

利用聚類分析軟件NTSYS2.1計算材料之間的遺傳相似系數(shù)（GS），分析材料間的遺傳差異，并通過UPGMA方法對7種風鈴草屬植物進行聚類分析。

2 結果與分析

2.1 ISSR分子標記多態(tài)性分析

從40個ISSR引物中篩選出28個（70%）能在風鈴草屬植物中擴增出清晰條帶的引物，各引物的擴增總條帶數(shù)、多態(tài)性條帶數(shù)、多態(tài)性比率、多態(tài)信息量見表2。28個引物總共擴增出164條條帶，每個引物所擴增的條帶數(shù)范圍為3～10條，平均5.9條。164個條帶中，有162個條帶具有多態(tài)性，多態(tài)性條帶百分率達到98.8%。其中，引物UBC856擴增出的條帶數(shù)最多，為10條；引物UBC827、UBC829、UBC847擴增出來的條帶數(shù)最少，均為3條。按照Anderson et al（1993）的方法計算了各引物所擴增的位點多態(tài)性信息量（PIC）的值。PIC值的范圍為0.571～0.954，均值為0.785。PIC值在0.7以下的只有引物UBC827、UBC828、UBC847，其中最小的為引物UBC827，其值為0.571。PIC值最大的為引物UBC829，其值高達0.954。其中，引物UBC846的擴增結果見圖1。

2.2 遺傳差異分析

風鈴草屬植物各種間的遺傳相似系數(shù)（GS）見表3，其變化范圍為0.421～0.945，變化范圍較大。其中，西南風鈴草與灰毛風鈴草、藏滇風鈴草與鉆裂風鈴草的遺傳相似性很高，遺傳距離很小，GS值分別為0.823和0.945。紫斑風鈴草、流石風鈴草以及灰?guī)r風鈴草與其它風鈴草之間的GS值都比較小，說明這三種風鈴草與其它風鈴草的遺傳距離較大，親緣關系較遠，這也符合它們的形態(tài)學特征。其中紫斑風鈴草與鉆裂風鈴草的GS值最小為0.421，說明它們之間的親緣關系最遠。

2.3 聚類分析

利用ISSR遺傳相似性矩陣按UPGMA方法進行聚類分析，構建了7種風鈴草屬植物的聚類圖（圖2）。圖2聚類結果顯示，當遺傳相似性系數(shù)為0.50時，7個物種可以聚為兩大類，其中西南風鈴草、灰毛風鈴草、紫斑風鈴草以及灰?guī)r風鈴草為第一大類；鉆裂風鈴草、藏滇風鈴草以及流石風鈴草為第二大類。從圖2還可發(fā)現(xiàn)，在不同的遺傳相似性水平上，第一大類和第二大類又可以繼續(xù)分出亞類，例如：當遺傳相似性系數(shù)為0.54時，第一大類分出了兩個亞類，第一大亞類為西南風鈴草、灰毛風鈴草以及灰?guī)r風鈴草，第二大亞類為紫斑風鈴草。當遺傳相似性系數(shù)為0.59時，第二大類也分出了兩個亞類，第一大亞類為流石風鈴草，第二大亞類為藏滇風鈴草和鉆裂風鈴草。當遺傳相似性系數(shù)為0.95時，七種風鈴草全部被區(qū)分開。

3 討論與結論

風鈴草屬植物種類較多，但在中國的分布較少，僅有19種，其中四川也只分布有9個種 （四川植物志編輯委員會，1999； 中國植物志編輯委員會，1990）。本研究在實驗材料的采集過程中發(fā)現(xiàn)，風鈴草屬植物生長海拔普遍較高，除紫斑風鈴草外，其它種均分布在海拔2 500 m以上的高山草甸。這些高山草甸是當?shù)啬撩竦闹饕拍羺^(qū)，風鈴草屬植物也是牦牛、馬等家畜的食物，因此風鈴草屬植物受家畜的干擾很大，加之其生長海拔高、環(huán)境惡劣，風鈴草屬植物的生存環(huán)境受到極大的威脅。目前，采集該屬植物的標本越發(fā)困難，因此開展該屬植物資源調查、親緣關系研究和引種栽培等研究迫在眉睫。ISSR標記具有多態(tài)性水平高、DNA用量少、特異性強、穩(wěn)定可靠等優(yōu)點，已廣泛應用于植物親緣關系的分析（林樂靜等，2015； 謝偉玲等，2017； 陳宗游等，2017）。本研究從40條ISSR引物中篩選出28條能在7種風鈴草屬植物中擴增出清晰且多帶性高的條帶，它們可以直接應用于這7種風鈴屬植物的親緣關系分析。

28條引物擴增出的總條帶數(shù)為164，其中有98.8%的擴增條帶具有多態(tài)性，遺傳相似性系數(shù)在0.421～0.945之間，且物種間遺傳相似性系數(shù)變化較大。這表明ISSR可以較好地反應風鈴草屬植物種間的親緣關系。供試的7種風鈴草屬植物中，鉆裂風鈴草與藏滇風鈴草，西南風鈴草與灰毛風鈴的親緣關系較近?？赡苁且驗殂@裂風鈴草與藏滇風鈴草，西南風鈴草與灰毛風鈴草的生存環(huán)境非常相似且分布區(qū)域存在重疊，在長期的自然演變過程中種質相互滲透造成的。聚類結果表明，7種風鈴草屬植物可以明顯地聚為4大類。西南風鈴草、灰毛風鈴草、灰?guī)r風鈴草聚為一類，這3個物種具有相似的形態(tài)特征，如根胡蘿卜狀，葉小、邊緣有鋸齒、背面有氈毛，花冠多呈紫色等（中國植物志編輯委員會，1990）；紫斑風鈴草與流石風鈴草各自單獨成一類，這兩種在形態(tài)上與其它各種風鈴草差異較大；最后是鉆裂風鈴草與藏滇風鈴草為一類。這也說明了形態(tài)特征相似的物種往往具有較近的親緣關系。通過聚類結果，可以發(fā)現(xiàn)7種風鈴草ISSR分子標記的聚類結果與傳統(tǒng)的分類的結果基本一致。這進一步證實ISSR分子標記可以對依靠表型為主的經典植物分類方法起到一個補充作用（Nagaraju et al，2002）。

風鈴草屬植物的花冠似鈴鐺、花大且顏色豐富，具有極高的觀賞價值。我國風鈴草屬植物資源并不豐富，且較多集中于川西地區(qū)，加上人為干擾影響，對原始生態(tài)環(huán)境的破壞，風鈴草屬資源受到了嚴重的威脅。因此，需要積極開展風鈴草屬植物的野生資源調查、引種馴化研究，并在此基礎上進一步通過雜交育種培育出觀賞價值高的新品種。一般而言，親本之間親緣關系越遠，雜交后代雜種優(yōu)勢越明顯，但雜交成功率也越低。因此，育種者充分掌握材料的遺傳背景信息、有針對地選配親本是風鈴草屬雜交育種的重要內容。本研究通過ISSR分子標記技術對風鈴草屬植物的親緣關系進行了客觀的分析，為該屬植物的雜交育種和分子標記輔助鑒定奠定了基礎。

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