黏菌素耐藥基因mcr—1 TaqMan—MGB熒光定量PCR檢測方法的建立

施開創(chuàng) 尹彥文 溫麗霞 屈素潔 王海清 胡杰

摘要：【目的】建立針對黏菌素耐藥基因mcr-1的TaqMan-MGB熒光定量PCR檢測方法，為監(jiān)控mcr-1基因攜帶細菌提供技術(shù)支持?！痉椒ā酷槍cr-1基因保守序列設計特異性引物和MGB探針，構(gòu)建重組質(zhì)粒作為陽性標準品，優(yōu)化引物、探針濃度及Rox參比染料用量、退火溫度等反應條件，建立針對mcr-1基因的TaqMan-MGB熒光定量PCR檢測方法，并通過特異性、敏感性、重復性試驗及臨床應用驗證其實用性。【結(jié)果】TaqMan-MGB熒光定量PCR最佳反應體系20.00 ?L：Premix Ex TaqTM 10.00 μL，Rox參比染料（50×）0.25 ?L，引物MCR-1F/MCR-1R（10 ?mol/L）各0.50 ?L，MCR-1-P探針（10 ?mol/L）0.50 ?L，重組質(zhì)粒pMCR-1（模板）2.00 μL，滅菌雙蒸水6.25 ?L。擴增程序：95 ℃預變性20 s；95 ℃ 10 s，60 ℃ 20 s，進行40個循環(huán)。該檢測方法能特異性擴增出mcr-1基因，其檢測敏感性為2.85拷貝/?L，是常規(guī)PCR的100倍，組內(nèi)和組間重復性試驗的變異系數(shù)為0.37%～1.18%，均小于1.20%。采用建立的TaqMan-MGB熒光定量PCR對82株廣西雞源致病性沙門氏菌分離株進行檢測，結(jié)果未發(fā)現(xiàn)有攜帶mcr-1基因的菌株?！窘Y(jié)論】針對mcr-1基因建立的TaqMan-MGB熒光定量PCR檢測方法具有特異性強、敏感性高、重復性好的特點，可用于臨床篩查mcr-1基因，為監(jiān)控mcr-1基因攜帶細菌提供技術(shù)支持。

關鍵詞： 黏菌素；mcr-1基因；TaqMan-MGB探針；熒光定量PCR

中圖分類號： S854.44 文獻標志碼：A 文章編號：2095-1191（2018）07-1447-06

0 引言

【研究意義】當前，細菌的耐藥性問題日益嚴重，給臨床醫(yī)學、獸醫(yī)臨床學及食品安全等領域帶來嚴峻挑戰(zhàn)（黎宗強等，2016；毛福超等，2016；王影等，2017；田亞凱，2018）。多黏菌素類抗生素因具有促進畜禽生長、抗菌作用等顯著優(yōu)勢，在養(yǎng)殖業(yè)中長期被世界各國作為飼料添加劑或治療藥物廣泛應用（Kempf et al.，2016；王影等，2017），由于細菌對黏菌素類抗生素的耐藥率一直較低，導致其耐藥性問題極易被忽視。隨著攜帶質(zhì)粒介導的黏菌素耐藥基因mcr-1及耐多黏菌素細菌被發(fā)現(xiàn)，并證實mcr-1基因可通過結(jié)合性質(zhì)粒在不同菌種間傳播，介導低水平的黏菌素耐藥（易靈嫻等，2017），說明其危害日趨嚴重，因此加強對攜帶質(zhì)粒介導黏菌素耐藥基因細菌的監(jiān)測和防控迫在眉睫。【前人研究進展】2016年，我國科學家首次在來自養(yǎng)殖場的黏菌素耐藥大腸桿菌分離株中發(fā)現(xiàn)可水平轉(zhuǎn)移的mcr-1基因（Liu et al.，2016），并證實mcr-1蛋白具有磷酸乙醇胺轉(zhuǎn)移酶活性，可催化磷酸乙醇胺與脂多糖表面類脂A結(jié)合，介導黏菌素耐藥。此后，在丹麥、泰國、尼日利亞、法國、英國、加拿大、美國、德國、突尼斯、日本、越南等國家也相繼發(fā)現(xiàn)mcr-1基因（Irrgang et al.，2016；McGann et al.，2016；王秀娜等，2017；易靈嫻等，2017）。至今，我國已從多個?。▍^(qū)、市）的人類或動物臨床樣品及環(huán)境樣品的細菌分離株中檢測到mcr-1基因，包括從動物排泄物、環(huán)境樣品（食品、水和蔬菜）、臨床樣品及健康群體（嬰兒）中分離獲得的多種腸桿菌科細菌[大腸桿菌（Escherichia coli）、沙門氏菌（Salmonella）等]及其他細菌[肺炎克雷伯氏菌（Klebsiella pneumoniae）、索氏志賀菌（Shigella sonnei）等]（Zurfuh et al.，2016；Cui et al.，2017；Huang et al.，2017；王秀娜等，2017；易靈嫻等，2017）?！颈狙芯壳腥朦c】多黏菌素被認為是細菌耐藥的最后一道防線，mcr-1基因廣泛且快速的傳播引發(fā)了全球性關注，因此急需建立針對mcr-1基因的快速檢測方法，用于監(jiān)測臨床流行菌株攜帶mcr-1基因的情況。【擬解決的關鍵問題】建立針對mcr-1基因的TaqMan-MGB熒光定量PCR檢測方法，為監(jiān)控mcr-1基因攜帶細菌提供技術(shù)支持。

1 材料與方法

1. 1 試驗材料

雞白痢沙門氏菌（S. pullorum）（CVCC538）、鼠傷寒沙門氏菌（S. typhimurium）（ATCC14028）、大腸桿菌（ATCC25922）和多殺性巴氏桿菌（Pasteurella multocida）（CVCC386）的質(zhì)控標準株購自中國獸醫(yī)微生物保藏中心。82株雞源致病性沙門氏菌由廣西動物疫病預防控制中心于2013～2017年分離獲得，其藥敏試驗結(jié)果表明均為多重耐藥菌株（黎宗強等，2016）。Premix Ex TaqTM試劑盒、pMD18-T載體、細菌基因組抽提試劑盒、質(zhì)粒DNA抽提試劑盒、mcr-1基因引物及MGB探針（表1）等均購自TaKaRa公司。

1. 2 重組質(zhì)粒標準品構(gòu)建

根據(jù)mcr-1基因序列，體外合成保守區(qū)域309 bp的單鏈DNA片段，經(jīng)PCR擴增該片段后克隆至pMD18-T載體上，即獲得攜帶mcr-1基因309 bp片段的陽性質(zhì)粒。以此為模板，利用引物對（MCR-1F/MCR-1R）進行擴增并將擴增產(chǎn)物克隆至pMD18-T載體上，獲得重組質(zhì)粒pMCR-1，鑒定正確后作為陽性標準品。

1. 3 反應條件確定和標準曲線繪制

以重組質(zhì)粒pMCR-1為模板，建立20.00 ?L的TaqMan-MGB熒光定量PCR反應體系，并采用方陣法對引物濃度（0.1～0.6 pmol/?L）、探針濃度（0.2～0.8 pmol/?L）、50倍稀釋后的Rox參比染料用量（0.2～0.5 ?L）及退火溫度（54～64 ℃）等反應條件逐一進行優(yōu)化，以確定熒光定量PCR的最佳反應條件。在此條件下，以2.85×109～2.85×103拷貝/?L的重組質(zhì)粒pMCR-1為模板進行PCR擴增，繪制擴增曲線和標準曲線。

1. 4 特異性、敏感性及重復性試驗

以重組質(zhì)粒pMCR-1及上述4種質(zhì)控標準菌株的總DNA為模板、滅菌雙蒸水為陰性對照，進行TaqMan-MGB熒光定量PCR擴增，以驗證其特異性。以2.85×106～2.85×100拷貝/?L的重組質(zhì)粒pMCR-1為模板進行TaqMan-MGB熒光定量PCR擴增，同時以2.85×109～2.85×101 拷貝/?L的重組質(zhì)粒pMCR-1為模板進行常規(guī)PCR擴增，確定其敏感性。此外，以2.85×108～2.85×104拷貝/?L的重組質(zhì)粒pMCR-1為模板進行重復性試驗，計算其變異系數(shù)。

1. 5 臨床應用

將82株廣西雞源致病性沙門氏菌分離株接種于LB培養(yǎng)液中37 ℃培養(yǎng)18～20 h，取培養(yǎng)菌液，采用細菌基因組DNA抽提試劑盒提取總DNA后，應用建立的TaqMan-MGB熒光定量PCR檢測mcr-1基因。

2 結(jié)果與分析

2. 1 重組質(zhì)粒pMCR-1鑒定結(jié)果

以包含mcr-1基因309 bp片段的質(zhì)粒為模板，利用引物對（MCR-1F/MCR-1R）擴增目的片段（133 bp），然后克隆至pMD18-T載體上構(gòu)建重組質(zhì)粒，并命名為pMCR-1。經(jīng)PCR擴增、雙酶切鑒定及測序分析正確后（圖1），作為陽性標準品用于后續(xù)試驗。根據(jù)OD260 nm/OD280 nm，可計算得到重組質(zhì)粒pMCR-1的濃度為109.989 μg/mL，即2.85×1010拷貝/μL。

2. 2 最佳反應條件

通過對引物、探針、Rox參比染料用量及退火溫度進行優(yōu)化試驗，結(jié)果確定TaqMan-MGB熒光定量PCR最佳反應體系20.00 ?L：Premix Ex TaqTM 10.00 μL，Rox參比染料（50×）0.25 ?L，引物MCR-1F/MCR-1R（10 ?mol/L）各0.50 ?L，MCR-1-P探針（10 ?mol/L）0.50 ?L，重組質(zhì)粒pMCR-1（模板）2.00 μL，滅菌雙蒸水6.25 ?L。擴增程序：95 ℃預變性20 s；95 ℃ 10 s，60 ℃ 20 s，進行40個循環(huán)。

2. 3 TaqMan-MGB熒光定量PCR的標準曲線

以2.85×109～2.85×103拷貝/?L的重組質(zhì)粒pMCR-1為模板，于最佳反應條件下進行TaqMan-MGB熒光定量PCR擴增，獲得的擴增曲線及標準曲線如圖2所示。標準曲線相關系數(shù)R2為0.999，即線性關系良好。

2. 4 特異性試驗結(jié)果

以重組質(zhì)粒pMCR-1及4種質(zhì)控標準菌株的DNA為模板，進行TaqMan-MGB熒光定量PCR特異性試驗，結(jié)果表明，只有重組質(zhì)粒pMCR-1可特異擴增出預期的目的產(chǎn)物（圖3），其他質(zhì)控標準株及陰性對照均未擴增出任何產(chǎn)物，說明該方法特異性強。

2. 5 敏感性試驗結(jié)果

以2.85×106～2.85×100 拷貝/?L的重組質(zhì)粒pMCR-1為模板，進行TaqMan-MGB熒光定量PCR的檢出下限為2.85拷貝/?L（圖4）；以2.85×109～2.85×101 拷貝/?L的重組質(zhì)粒pMCR-1為模板，進行常規(guī)PCR的檢出下限為2.85×102 拷貝/?L（圖5），即TaqMan-MGB熒光定量PCR的敏感性是常規(guī)PCR的100倍。

2. 6 重復性試驗結(jié)果

以2.85×108～2.85×104拷貝/?L的重組質(zhì)粒pMCR-1為模板進行TaqMan-MGB熒光定量PCR重復性試驗，結(jié)果顯示，組內(nèi)和組間重復性試驗的變異系數(shù)為0.37%～1.18%（表2），均小于1.20%，即重復性好。

2. 7 臨床樣品檢測結(jié)果

采用建立的TaqMan-MGB熒光定量PCR對82株廣西雞源致病性沙門氏菌分離株進行檢測，結(jié)果未發(fā)現(xiàn)有攜帶mcr-1基因的菌株。

3 討論

當前，攜帶mcr-1基因的細菌主要集中在大腸桿菌、沙門氏菌、肺炎克雷伯氏菌和阪崎腸桿菌等，來自人源、動物源、食品源及環(huán)境源等（王秀娜等，2017；易靈嫻等，2017）。mcr-1基因由質(zhì)粒攜帶，可通過流行性質(zhì)?；蚩梢苿釉诓煌瑖液偷貐^(qū)的人源、動物源和環(huán)境源多種細菌間廣泛傳播，且攜帶該基因的質(zhì)粒具有多樣性和復雜性，一旦呈全球性傳播和蔓延，勢必給畜牧業(yè)生產(chǎn)及公共衛(wèi)生安全帶來全新的挑戰(zhàn)，因此亟待建立針對mcr-1基因的TaqMan-MGB熒光定量PCR檢測方法，為監(jiān)控mcr-1基因攜帶細菌提供技術(shù)支持。自mcr-1基因（Liu et al.，2016）被發(fā)現(xiàn)以來，攜帶此基因的細菌種類日益增多，已嚴重威脅畜牧業(yè)發(fā)展及公共衛(wèi)生安全（Chen et al.，2017；Gay et al.，2017），因此迫切需要加強對攜帶mcr-1基因耐藥細菌的監(jiān)控。至今，針對mcr-1基因檢測技術(shù)的研究已有報道。Cannatelli等（2016）建立了檢測mcr-1基因的PCR；Chabou等（2016）、von Wintersdorff等（2016）建立了針對mcr-1基因的TaqMan熒光定量PCR；在此基礎上，Li等（2017）建立了SYBR Green熒光定量PCR檢測方法，Imirzalioglu等（2017）、Zou等（2017）建立了環(huán)介導等溫擴增技術(shù)（LAMP）。這些檢測方法均可特異性擴增出mcr-1基因，也未出現(xiàn)與其他基因的交叉反應；對模板的檢出下限表現(xiàn)為：常規(guī)PCR為103拷貝/μL數(shù)量級，SYBR Green熒光定量PCR和LAMP為102拷貝/μL數(shù)量級，TaqMan熒光定量PCR為101拷貝/μL數(shù)量級。本研究首次建立針對mcr-1基因的TaqMan-MGB熒光定量PCR，其檢測下限為2.85拷貝/μL，屬于101拷貝/μL數(shù)量級，敏感性與TaqMan熒光定量PCR相當，是SYBR Green熒光定量PCR和LAMP的10倍，是常規(guī)PCR的100倍。即臨床上可用于監(jiān)控mcr-1基因攜帶細菌的突變規(guī)律。

沙門氏菌是主要的人畜共患病原菌之一，目前國內(nèi)外均已發(fā)現(xiàn)有攜帶mcr-1基因的沙門氏菌分離株。Campos等（2016）對2002～2015年來自葡萄牙的1010株人源、豬源沙門氏菌進行檢測，結(jié)果顯示，從2011～2015年的分離株中均能檢測到mcr-1基因，其中人源分離株陽性率為0.8%（4/522）、豬源分離株陽性率為2.4%（7/296）。Carnevali等（2016）對2012～2015年來自意大利的4473株沙門氏菌分離株（人源3294株、動物源1143株、環(huán)境源36株）進行檢測，結(jié)果表明，mcr-1基因陽性率在人源分離株為0.3%（10/3294）、在動物源分離株為1.3%（15/1143）、在環(huán)境源分離株為0。EI Garch等（2018）通過檢測2002～2014年來自歐洲11個國家的1174株動物源沙門氏菌，結(jié)果發(fā)現(xiàn)mcr-1基因陽性率為0.2%（2/1174）。在我國，曹陽等（2017）對2011～2014年分離的404株非傷寒沙門菌（人源204株、動物源128株、食品源72株）進行檢測，結(jié)果僅在1株人源沙門菌中檢測到mcr-1基因；Cui等（2017）檢測了2012～2015年分離的2034株人源沙門氏菌，結(jié)果顯示mcr-1基因陽性率為1.4%（28/2034）；Yi等（2017）通過檢測2013～2014年從屠宰場分離的142株豬源沙門菌，結(jié)果發(fā)現(xiàn)mcr-1基因檢出率為14.8%（21/142）。本課題組于2013～2017年從廣西各地疑似患沙門氏菌病的病死雞群中分離鑒定出82株致病性沙門氏菌，藥敏試驗證實這些分離株對苯唑西林、阿莫西林、鏈霉素、磺胺甲惡唑、四環(huán)素和呋喃妥因等多種抗菌素表現(xiàn)出多重耐藥（黎宗強等，2016），對多黏菌素E的耐藥率為40.24%（33/82），但以本研究建立的TaqMan-MGB熒光定量PCR進行檢測，未發(fā)現(xiàn)攜帶mcr-1基因的菌株，具體原因有待進一步探究。

4 結(jié)論

針對mcr-1基因建立的TaqMan-MGB熒光定量PCR檢測方法具有特異性強、敏感性高、重復性好的特點，可用于臨床篩查mcr-1基因，為監(jiān)控mcr-1基因攜帶細菌提供技術(shù)支持。

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（責任編輯 蘭宗寶）