密度脅迫對黑鯛運輸存活率及免疫酶活性的影響

李丹丹 陳丕茂 朱愛意 袁華榮 馮雪 王文杰

摘要：【目的】研究密度脅迫對黑鯛魚苗運輸存活率及免疫酶活性的影響，篩選出適宜的運輸密度，為黑鯛科學運輸提供參考依據?！痉椒ā窟x取體長9.0～11.7 cm的健康黑鯛魚苗490尾，共設5個密度組（D1、D2、D3、D4和D5），每袋對應裝入黑鯛魚苗10、15、20、25和30尾，采用塑料袋充氧密封運輸方式，運輸時間2 h 45 min，分別于運輸后0、6、12、24和48 h共5個時間點取樣檢測，對比不同密度運輸后黑鯛幼魚鰓絲Na+/K+-ATPase酶（NKA）和肝臟超氧化物歧化酶（SOD）、過氧化氫酶（CAT）、乳酸脫氫酶（LDH）活性及總蛋白（TP）、丙二醛（MDA）含量的變化?！窘Y果】采用塑料袋充氧密封運輸方式，各密度組的黑鯛魚苗存活率均為100%，運輸后恢復48 h的存活率仍為100%。經塑料袋充氧密封運輸2 h 45 min后，各密度組黑鯛魚苗鰓絲組織中的NKA活性顯著低于運輸前水平（P<0.05，下同），肝臟組織中的SOD和CAT活性顯著高于運輸前水平，但三者均在恢復12 h后達到峰值；肝臟組織中的MDA含量整體上呈先增后降的變化趨勢，除D1組外其他密度組的MDA含量均在恢復6 h后達到峰值，隨后緩慢下降，恢復48 h后D1、D2、D3和D4組的MDA含量基本恢復到運輸前水平；肝臟組織中的TP含量顯著低于運輸前水平，恢復48 h后其含量明顯升高，但仍低于運輸前水平；肝臟組織中的LDH活性隨時間推移的變化趨勢各不相同，D1、D2和D3組的LDH活性整體上呈逐漸降低趨勢，D4和D5組的LDH活性則呈先增后降的變化趨勢。【結論】密度脅迫對黑鯛魚苗運輸存活率無影響，但其免疫酶活性及代謝能力均受影響，需在運輸后暫養(yǎng)48 h才開始或基本恢復到運輸前水平。在實際生產中，采用塑料袋充氧密封運輸且運輸時間不超過3 h時，以每袋裝20～25尾9.0～11.7 cm規(guī)格的黑鯛魚苗為宜。

關鍵詞： 黑鯛；運輸密度脅迫；存活率；免疫酶活性

中圖分類號： S965.231 文獻標志碼：A 文章編號：2095-1191（2018）07-1439-08

0 引言

【研究意義】魚類屬于低等脊椎動物，極易受外界環(huán)境影響，且在不同生長發(fā)育階段不同魚種甚至相同魚種不同個體對各種環(huán)境脅迫的抵抗能力存在明顯差異（洪磊和張秀梅，2004）。魚類種苗期是其生長的關鍵時期，此時其免疫抵抗能力較弱，更易受外界環(huán)境影響，尤其在增殖放流和養(yǎng)殖生產過程中，拉網、捕捉、排污和運輸?shù)炔僮骶豢杀苊獾卦黾郁~類額外能量消耗，致使其產生應激反應。雖然應激反應是一種條件反射式的保護機制，但機體持續(xù)處于應激狀態(tài)，則會增加各類病原的敏感性甚至導致魚病暴發(fā)（王文博等，2004；翁朝紅等，2008；王麗娜等，2017）。運輸作為魚類生產養(yǎng)殖和放流工作中的必需環(huán)節(jié)，集合了密度變化、操作、振動及運輸水體環(huán)境變化等眾多脅迫因子，會引發(fā)機體發(fā)生一系列的快速生理變化（Koolhaas et al.，2011）。因此，研究運輸脅迫因子對魚類免疫及代謝能力的影響，對確定最適運輸方式及評估魚苗放養(yǎng)存活率等具有重要意義?！厩叭搜芯窟M展】關于水產活體運輸，至今已有諸多學者開展了相關研究，尤其是運輸后魚體血清和組織中皮質醇、血糖、乳酸及游離脂肪酸等的變化情況（Urbinati et al.，2004；洪磊和張秀梅，2005；Boerrigter et al.，2015；Honryo et al.，2018）。Barton等（2003）研究了玻璃梭鱸幼魚在捕撈、運輸及放流過程中血漿皮質醇和氯化物的應激反應；Urbinati等（2004）研究了頭石脂鯉幼魚在裝卸及不同密度運輸后皮質醇和血糖等生理指標的變化情況；洪磊和張秀梅（2005）研究發(fā)現(xiàn)，停食24 h后的許氏平鮋和花鱸經運輸船運輸后裝入雙層充氣塑料袋再以汽車運輸，二者的血糖含量均呈上升趨勢；彭士明等（2011）研究表明，銀鯧幼魚在4、8和16 g/L的運輸密度下運輸12 h后，其血清皮質醇、血糖和肌肉乳酸含量均顯著升高，但肝臟和肌肉組織中的糖元含量顯著降低；寇祥明等（2012）以克氏原螯蝦苗為研究對象，開展了不同鹽度條件下運輸模擬試驗，結果發(fā)現(xiàn)在運輸時間相同和同等鹽度條件下，NaCl組的運輸效果優(yōu)于Na2SO4組；孫鵬等（2014）研究表明，日本黃姑魚經箱式貨車（60 km/h）連續(xù)運輸6 h，其肝臟中超氧化物歧化酶（SOD）和過氧化氫酶（CAT）活力快速升高并顯著高于運輸前，之后逐漸下降恢復到正常水平，同時證實SOD和CAT可作為有效的生物指示劑用于脅迫狀態(tài)檢測；Tacchi等（2015）研究表明，虹鱒的皮膚及皮膚微生物在運輸應激期間發(fā)生了重要的生理反應，即活體運輸前必須檢測魚體皮膚的健康情況，運輸過程中則需關注其體色變化情況；Honryo等（2018）研究表明，運輸后前3 d是金槍魚魚苗運輸脅迫恢復的關鍵時期，有必要采取適當?shù)募夹g管理手段以減少死亡率?！颈狙芯壳腥朦c】黑鯛又名黑棘鯛（Sparus inacrocephalus），俗稱海鮒、青郎、烏頰、牛屎鱲、烏翅、黑加吉、海鯽、銅盆魚等，其肉質鮮美，營養(yǎng)豐富，具有較高的經濟價值，是我國沿海地區(qū)重要的增殖放流和養(yǎng)殖品種，但至今未見運輸脅迫對黑鯛魚苗影響的相關研究報道。【擬解決的關鍵問題】以黑鯛魚苗為研究對象，采取塑料袋密封充氧運輸方式，對比不同密度運輸后黑鯛幼魚鰓絲Na+/K+-ATPase酶（NKA）和肝臟SOD、CAT、LDH活性及總蛋白（TP）、丙二醛（MDA）含量的變化，篩選出適宜的運輸密度，為黑鯛科學運輸提供參考依據。

1 材料與方法

1. 1 試驗材料

黑鯛魚苗購自廣東大亞灣南澳養(yǎng)殖場，選取健康活潑的魚苗共490尾，其體長9.0～11.7 cm，平均10.9±1.0 cm，體質量10.5～20.7 g/尾，平均18.2±3.8 g/尾。采用養(yǎng)殖生產和增殖放流中常用的塑料袋密封充氧運輸方式，運輸用透明塑料袋規(guī)格長50 cm、寬30 cm（未充氧時），每袋裝入育苗池海水4400 mL（水溫27.7 ℃，鹽度27‰，pH 8.04）。

1. 2 模擬運輸試驗

共設5個密度組（D1、D2、D3、D4和D5），即每袋對應裝入黑鯛魚苗10、15、20、25和30尾，每組設3個平行。每袋充氧至飽和后立即用塑料圈封閉，試驗過程中每30 min晃動3下以便氧氣與海水混合。黑鯛魚苗裝袋后用別克商務車運輸，運輸過程中調節(jié)車內溫度保持27.0 ℃。運輸起點為大亞灣南澳養(yǎng)殖場，終點為中國水產科學研究院南海水產研究所深圳試驗基地，運輸時間2 h 45 min，全程禁食。運輸結束后，將各密度組魚苗分別暫養(yǎng)于可控溫暫養(yǎng)池（水溫27.0 ℃，鹽度29‰，pH 8.00）的不同網箱內。

1. 3 樣品采集與檢測分析

分別在運輸結束后的0、6、12、24和48 h共5個時間點取樣，同時從廣東大亞灣南澳養(yǎng)殖場育苗池隨機采集9尾黑鯛魚苗為對照。樣品魚置于碎冰上快速解剖取其鰓絲和肝臟組織，以電子天平稱重，按1∶9（g/mL）比例加入9倍的0.86%生理鹽水，液氮研磨，2500 r/min離心10 min，收集上清液，-80 ℃保存。鰓絲NKA活性及肝臟TP含量、MDA含量、SOD活性、CAT活性和LDH活性均采用南京建成生物工程研究所研發(fā)的試劑盒進行檢測分析。

1. 4 統(tǒng)計分析

試驗數(shù)據采用Excel 2010進行統(tǒng)計分析，并以SPSS 19.0中的Duncans進行多重比較。

2 結果與分析

2. 1 密度脅迫運輸后黑鯛魚苗的存活率

從大亞灣南澳養(yǎng)殖場運輸至中國水產科學研究院南海水產研究所深圳試驗基地，運輸時間2 h 45 min，不同密度組的黑鯛魚苗存活率均為100%，運輸后恢復48 h的存活率仍為100%。

2. 2 密度脅迫運輸后黑鯛魚苗鰓絲組織中的NKA活性

經塑料袋充氧密封運輸2 h 45 min后，各密度組黑鯛魚苗鰓絲組織中的NKA活性隨時間推移呈波動性變化，且低密度組的酶活性整體上高于高密度組。運輸后0 h，各密度組的NKA活性均顯著低于對照組（P<0.05，下同），且低密度組的NKA活性高于高密度組；恢復12 h后各密度組的NKA活性均達到峰值，恢復24 h后各密度組的酶活性降至最低水平，但在恢復48 h后各密度組的NKA活性呈緩慢回升趨勢，其中，D1、D2和D3組基本恢復到運輸前水平（圖1）。

2. 3 密度脅迫運輸后黑鯛魚苗肝臟組織中各指標的變化規(guī)律

2. 3. 1 SOD活性 經塑料袋充氧密封運輸后，各密度組黑鯛魚苗肝臟組織中的SOD活性整體上顯著高于運輸前水平，且密度脅迫與SOD活性呈負相關。運輸后0 h，各密度組的SOD活性顯著高于對照組；恢復12 h后各密度組的SOD活性達到峰值，此后SOD活性緩慢降低，至恢復48 h后，D1～D4組的SOD活性仍顯著高于對照組，而D5組的SOD活性顯著低于對照組（圖2）。

2. 3. 2 CAT活性 經塑料袋充氧密封運輸后，各密度組黑鯛魚苗肝臟組織中的CAT活性呈波動性變化，且低密度組的CAT活性高于高密度組。運輸后0 h，各密度組的CAT活性顯著高于運輸前水平，其中，D1和D2組的CAT活性顯著高于其他密度組，D4和D5組的CAT活性相近；恢復12 h后各密度組的CAT活性達最高值，隨后緩慢下降；恢復48 h后，D1和D2組的CAT活性仍顯著高于運輸前水平，D3和D4組的CAT活性基本恢復到運輸前水平，D5組的CAT活性則顯著低于運輸前水平（圖3）。

2. 3. 3 MDA含量 經塑料袋充氧密封運輸后，各密度組黑鯛魚苗肝臟組織中的MDA含量整體上呈先增后降的變化趨勢，且MDA含量與密度呈正相關，高密度組的MDA含量波動明顯大于低密度組。運輸后0 h，D1和D2組的MDA含量略高于運輸前水平，但差異不顯著（P>0.05），D5組MDA含量則顯著高于對照組；除D1組外其他密度組的MDA含量均在恢復6 h后達到峰值，隨后緩慢下降；恢復48 h后D1、D2、D3和D4組的MDA含量基本恢復到運輸前水平，而D5組的MDA含量顯著高于運輸前水平（圖4）。

2. 3. 4 TP含量 經塑料袋充氧密封運輸后，各密度組黑鯛魚苗肝臟組織中的TP含量均低于對照組，且低密度組的TP含量高于高密度組。各密度組的TP含量隨時間推移呈輕微波動性變化。運輸后0 h，D1和D2組的TP含量相近，但顯著高于其他密度組；恢復6～24 h，各密度組的TP含量有輕微波動，但在恢復48 h后，各密度組的TP含量均顯著升高，其中，D1組的TP含量基本恢復到運輸前水平，其他密度組的TP含量仍顯著低于對照組（圖5）。

2. 3. 5 LDH活性 經塑料袋充氧密封運輸后，各密度組黑鯛魚苗肝臟組織中的LDH活性隨時間推移的趨勢各不相同，D1、D2和D3組的LDH活性整體上呈逐漸降低趨勢，D4和D5組的LDH活性則呈先增后降的變化趨勢。運輸后0 h，各密度組的LDH活性均顯著高于對照組，且低密度組的LDH活性高于高密度組；恢復12 h后，D4和D5組的LDH活性達最高值；恢復48 h后，D1和D2組的LDH活性基本恢復到運輸前水平，D3、D4和D5組的LDH活性仍顯著高于對照組（圖6）。

3 討論

3. 1 密度脅迫運輸對黑鯛魚苗鰓絲組織中NKA活性的影響

NKA鑲嵌在細胞膜類脂雙分子層中，是一種具有腺苷酸三磷酸酶活性的特異蛋白質，其在離子平衡、能量代謝、物質運送、氧化磷酸化和維持細胞膜完整性等方面發(fā)揮重要作用，被認為是評價機體對外界脅迫敏感性的重要生物酶之一（王維娜等，2004；譚樹華等，2007；蘇慧等，2012）。由于NKA在魚類鰓組織中保持較高活力，便于啟動膜蛋白運輸及離子通道以維持細胞內環(huán)境（滲透壓調節(jié)和離子平衡），因此鰓組織是魚類最主要的NKA活力器官（Evans et al.，2005；Yang et al.，2009）。已有研究表明，環(huán)境突變引起的滲透壓改變，能促使機體新陳代謝變化，NKA被激活，直至滲透壓趨于平衡（He et al.，2009）。例如，史氏鱘和條石鯛為適應外界環(huán)境的變化，其鰓組織NKA活性調節(jié)分為3個階段，即應激反應階段、主動調節(jié)階段和適應階段（趙峰等，2006；孫鵬等，2014）。本研究結果表明，經塑料袋充氧密封運輸后，各密度組黑鯛魚苗鰓組織中的NKA活性顯著降低，但恢復12 h后各密度組的NKA活性均達峰值，恢復24 h后各密度組的酶活性又降至最低水平，與趙峰等（2006）的研究結論相同。恢復前期鰓組織中NKA活性降低，可能是處于應激反應階段，密度脅迫運輸后的黑鯛魚苗呼吸頻率變慢致使細胞膜的通透性受抑制而阻止過多離子滲透，呈被動式滲透壓調整（Rodríguez et al.，2002）；而后隨著機體的恢復，NKA活性不斷提高，離子外排機制激活，黑鯛開始主動調節(jié)滲透壓；恢復48 h后，D1、D2和D3組NKA活性基本恢復到運輸前水平，說明機體調節(jié)基本維持了魚體內外的滲透平衡。

3. 2 密度脅迫運輸對黑鯛魚苗肝臟組織中SOD和CAT活性的影響

研究SOD和CAT的動態(tài)變化可推測出機體體內自由基的代謝及組織的氧化損傷程度，對判斷機體免疫防御能力具有重要意義（洪美玲等，2007）。SOD和CAT作為生物體內的主要抗氧化酶，SOD將機體內產生的活性氧自由基（ROS）分解成H2O2，CAT則將H2O2還原成氧分子和水，從而維持細胞或機體的正常生理活動（Parihar et al.，1997）。本研究結果表明，經塑料袋充氧密封運輸后，各密度組黑鯛魚苗肝臟組織中的SOD和CAT活性均高于運輸前水平，是由于運輸密度脅迫造成黑鯛魚苗體內ROS過量產生，進而誘發(fā)抗氧化酶活性增強（李效宇等，2003）；恢復12 h后SOD和CAT活性達到峰值，與謝明媚等（2015）對銀鯧幼魚脅迫處理后的研究結果相似；而后逐漸降低，恢復48 h后，D1和D2組的SOD和CAT活性仍顯著高于運輸前水平，D5組的SOD和CAT活性則顯著低于運輸前水平。說明低密度組黑鯛魚苗能通過機體產生的SOD和CAT及時清除脅迫產生的自由基，從而維持正常的生理代謝；但高密度組由于受密度脅迫運輸?shù)挠绊戄^大，其機體內積累大量自由基而造成機體損傷，致使其抗氧化能力下降（陳成勛等，2011）。

3. 3 密度脅迫運輸對黑鯛魚苗肝臟組織中MDA含量的影響

MDA不僅是反映機體脂質過氧化程度的指標，還能表征細胞膜的受損程度（陳海剛等，2009）。本研究發(fā)現(xiàn)，經塑料袋充氧密封運輸后，D1和D2組黑鯛魚苗肝臟組織中的MDA含量與對照組接近，隨著恢復時間的推移，其變化程度較緩且在恢復48 h后基本恢復到運輸前水平，與謝明媚等（2015）研究報道的急性溫度脅迫處理后銀鯧幼魚的變化規(guī)律相似。說明D1和D2組黑鯛魚苗受密度脅迫運輸產生的自由基能夠被體內的SOD和CAT及時清除，有效維持抗氧化系統(tǒng)的平衡。除D1組外其他密度組的MDA含量均在恢復6 h后達峰值，隨后逐步下降；恢復48 h后，D3組的MDA含量基本與運輸前水平一致，而D5組的MDA含量顯著高于運輸前水平。說明黑鯛魚苗受密度脅迫影響較大時，機體內產生的過量自由基打破了原有的氧化平衡，進而引發(fā)脂質過氧化反應（馮連華，2012）。

3. 4 密度脅迫運輸對黑鯛魚苗肝臟組織中TP含量的影響

魚類的主要能量來源有糖類、脂肪和蛋白質，當魚類面臨環(huán)境脅迫時，體內能量代謝發(fā)生的主要變化包括：血糖和血液乳酸含量增高，肝糖原加速消耗，游離脂肪酸含量發(fā)生變化，蛋白質分解加快（周玉等，2001；馮廣朋等，2010）。由于應激狀態(tài)下魚類需要更多地動用自身儲存的能量，當機體體內的糖類和脂肪含量較低時，蛋白質通過一系列生化分解后進入血液為各組織器官供能（錢云霞等，2002）。本研究結果發(fā)現(xiàn)，密度脅迫運輸后黑鯛魚苗肝臟組織中的TP含量顯著低于運輸前水平，且低密度組的TP含量高于高密度組。錢云霞等（2002）研究表明，饑餓脅迫下的鱸魚體內TP含量隨饑餓時間延長而下降；賽娜和宋凱（2011）研究表明，溫度偏高或偏低均會使中華鱘魚體內TP含量下降，運輸脅迫后牙鲆TP含量也呈降低趨勢。說明密度脅迫運輸會促使黑鯛魚苗處于應激狀態(tài)，且對其免疫機能造成一定影響?；謴?8 h后，除D1組的TP含量基本恢復到運輸前水平外，其他密度組的TP含量仍顯著低于運輸前水平，尤其是D5組的黑鯛魚苗可能因密度脅迫影響較大，致使其能量分解代謝加快，而導致TP含量一直保持在較低水平。

3. 5 密度脅迫運輸對黑鯛魚苗肝臟組織中LDH活性的影響

LDH是糖酵解途徑與TCA循環(huán)的關鍵酶，不僅與細胞代謝關系密切，還可通過催化丙酮酸和乳酸直接轉化產生能量（Valarmathi and Azariah，2003；Abdelmohsen，2012）。LDH活性從根本上取決于細胞內氧分壓的高低，氧分壓降低時，LDH合成加快且活力增強，因此可作為一種衡量無氧代謝水平的指標（趙偉民等，2011）。當機體組織器官發(fā)生病變時，其自身的LDH也會發(fā)生變化，即LDH在評價魚類健康方面具有重要意義（毛瑞鑫等，2009）。經鉛暴露脅迫處理后中華鱘幼魚體內的LDH活性升高且隨脅迫的增加而增強（章龍珍等，2010）。本研究結果表明，經密度脅迫運輸后，D1、D2和D3組黑鯛魚苗肝臟組織中的LDH活性在恢復期整體上呈逐漸降低趨勢，恢復48 h后，D1和D2組的LDH活性基本恢復到運輸前水平。運輸后各密度組的LDH活性升高表明密度脅迫運輸增加了魚體的游動，以此調節(jié)適應環(huán)境變化和維持生命代謝比例的增加，脅迫處理期間無氧呼吸增加（李佳凱等，2015）。LDH從肝胰臟攜帶膽固醇輸送到周圍血管，其活性增強時可造成過多的膽固醇存積在血管壁上，引起動脈粥樣硬化，即過高的LDH不利于健康（李彥明等，2008）。由此推測，D4和D5組黑鯛魚苗肝臟組織受損較嚴重。

4 結論

密度脅迫對黑鯛魚苗運輸存活率無明顯影響，但其免疫酶活性及代謝能力均受影響，需在運輸后暫養(yǎng)48 h才開始或基本恢復到運輸前水平。在實際生產中，采用塑料袋充氧密封運輸且運輸時間不超過3 h時，以每袋裝20～25尾9.0～11.7 cm的黑鯛魚苗為宜。

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（責任編輯 蘭宗寶）