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    疏肝健脾解毒方對(duì)人乳腺癌細(xì)胞MCF—7增殖及凋亡的影響

    2018-09-10 16:56:31李琳霈楊曉潘博譚小寧羅吉蔣益蘭
    關(guān)鍵詞:疏肝注射用健脾

    李琳霈 楊曉 潘博 譚小寧 羅吉 蔣益蘭

    〔摘要〕 目的 研究中藥疏肝健脾解毒方對(duì)人乳腺癌細(xì)胞MCF-7增殖及凋亡的影響。方法 采用CCK8法檢測(cè)藥物干預(yù)12 h、24 h、48 h后對(duì)MCF-7細(xì)胞增殖的影響(分為空白對(duì)照組、陽(yáng)性藥物對(duì)照組及不同濃度中藥組);采用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)藥物干預(yù)36 h及48 h后對(duì)細(xì)胞晚期凋亡率的影響(分為空白對(duì)照組、中藥組及陽(yáng)性藥物對(duì)照組)。結(jié)果 中藥組吸光度低于空白組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),且隨藥物濃度增高,吸光度逐漸降低;12 h至24 h,隨著作用時(shí)間延長(zhǎng),吸光度亦逐漸降低;24 h后較高濃度中藥組吸光度與陽(yáng)性對(duì)照組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。與空白組比較,中藥組細(xì)胞晚期凋亡率較高,差異有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01),但中藥組細(xì)胞凋亡率低于陽(yáng)性對(duì)照組,差異有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。結(jié)論 疏肝健脾解毒方對(duì)人乳腺癌細(xì)胞MCF-7增殖有一定的抑制作用,可能通過(guò)誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡實(shí)現(xiàn)。

    〔關(guān)鍵詞〕 疏肝健脾解毒方;人乳腺癌細(xì)胞MCF-7;細(xì)胞增殖;細(xì)胞凋亡

    〔中圖分類號(hào)〕R285.5;R273 〔文獻(xiàn)標(biāo)志碼〕A 〔文章編號(hào)〕doi:10.3969/j.issn.1674-070X.2018.06.008

    〔Abstract〕 Objective To study the effect of Shugan Jianpi Jiedu decoction on proliferation and apoptosis of human breast cancer cell line MCF-7. Methods The MCF-7 cells were intervened with drugs for 12 h, 24 h and 48 h (assigned into blank control group, positive drug control group and different concentrations of TCM groups), then MCF-7 cells proliferation was detected by CCK8 method. The apoptosis rate of the cells was measured by flow cytometry after intervention with drugs for 36 h and 48 h. Results The absorbance of TCM groups was lower than that of the blank group, the difference was statistically significant (P<0.05). The absorbance decreased gradually with the increase of drug concentration, and reduced gradually with the extension of time from 12 h to 24 h, while after 24 h, the absorbance between the high concentration TCM group and the positive control group was not statistically significant (P>0.05). The cell apoptosis rate in TCM groups was higher than that in blank group, the difference was statistically significant (P<0.01), but was significantly lower than that in positive group (P<0.01). Conclusion Shugan Jianpi Jiedu decoction exhibits certain inhibitory effect on human breast cancer cell MCF-7 proliferation, and its mechanism maybe through inducing cell apoptosis.

    〔Keywords〕 Shugan Jianpi Jiedu decoction; human breast cancer cell line MCF-7; cell proliferation; cell apoptosis

    乳腺癌是女性最常見(jiàn)的惡性腫瘤之一。自2008年以來(lái),乳腺癌的發(fā)病率增加20%以上,死亡率增加了14%[1]。乳腺癌的發(fā)病率逐年上升,在我國(guó)發(fā)達(dá)城市,特別是在一些大城市及沿海經(jīng)濟(jì)發(fā)展較快的地區(qū),已占女性惡性腫瘤發(fā)病的首位[2],嚴(yán)重威脅著女性身體健康?!笆韪谓∑⒔舛痉健睘槲以褐委熑橄侔┑慕?jīng)驗(yàn)方,經(jīng)多年臨床實(shí)踐,我們運(yùn)用該方治療乳腺癌患者取得良好療效。為進(jìn)一步明確其作用機(jī)理,我們進(jìn)行了相關(guān)實(shí)驗(yàn)研究[3],本實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步探討疏肝健脾解毒方提取液對(duì)人乳腺癌細(xì)胞MCF-7的影響,現(xiàn)報(bào)道如下。

    1 材料

    1.1 細(xì)胞株及藥物

    人乳腺癌細(xì)胞MCF-7由中南大學(xué)湘雅醫(yī)學(xué)院國(guó)家重點(diǎn)腫瘤研究所贈(zèng)送;疏肝健脾解毒方由柴胡10 g,郁金10 g,茯苓10 g,白術(shù)10 g,白花蛇舌草30 g,半枝蓮30 g,蒲公英30 g組成。由湖南省中醫(yī)藥研究院附屬醫(yī)院中藥房提供;陽(yáng)性對(duì)照藥注射用鹽酸吡柔比星購(gòu)自深圳萬(wàn)樂(lè)藥業(yè)有限公司,規(guī)格:10 mg/瓶,國(guó)藥準(zhǔn)字:H0930105,產(chǎn)品批號(hào):1605C8。

    1.2 主要試劑及儀器

    DMEM高糖培養(yǎng)基(Gibco,批號(hào):8116293);胎牛血清(PAN,批號(hào):P160704);0.25%胰蛋白酶(Gibco,批號(hào):8252000);CCK8(七海生物有限公司,批號(hào)20161106);青霉素-鏈霉素混合液(Hyclone,批號(hào):J160002);磷酸鹽緩沖液(Hyclone,批號(hào):AB218110)。細(xì)胞培養(yǎng)箱(Thermo,型號(hào):HERAcell 2401);超凈工作臺(tái)(法國(guó) JouanMSC12);高速離心機(jī)(湖南賽特湘儀,TG16-WS);全自動(dòng)酶標(biāo)儀(BioTek,型號(hào):EIX808U);流式細(xì)胞分析儀(美國(guó)BD,型號(hào):BD FACSCalibur)。

    2 方法

    2.1 藥物制備

    疏肝健脾解毒方由柴胡10 g,郁金10 g,茯苓10 g,白術(shù)10 g,白花蛇舌草30 g,半枝蓮30 g,蒲公英30 g組成。取以上中藥處方劑,用10倍溫水浸泡0.5 h,大火加熱煎煮,水開(kāi)后繼續(xù)煎煮0.5 h,趁熱過(guò)濾。藥渣再加8倍水煎煮2次,每次0.5 h,趁熱過(guò)濾。將3次水煎液混合、過(guò)濾,減壓濃縮為濃度為1 g/mL的溶液,在超凈工作臺(tái)內(nèi)以0.22 ?滋m微孔濾膜過(guò)濾除菌后,分裝于1.5 mL無(wú)菌EP管內(nèi),4 ℃保存?zhèn)溆?。注射用鹽酸吡柔比星于生物安全柜內(nèi)用注射用無(wú)菌生理鹽水配制成1 mg/mL的溶液,分裝于1 mL無(wú)菌EP管內(nèi),置于-20 ℃冰箱備用。將中藥及陽(yáng)性對(duì)照藥溶液均于臨用前加入DMEM培養(yǎng)基配成所需濃度,并檢測(cè)配制液pH值及滲透壓,確保其pH值及滲透壓均保持在正常培養(yǎng)基的可波動(dòng)范圍(pH7.2~7.4、滲透壓280~320 m·sm/kg),必要時(shí)用無(wú)菌HCL和NaOH調(diào)整溶液pH值,以無(wú)菌NaCl調(diào)整溶液滲透壓。

    2.2 人乳腺癌細(xì)胞培養(yǎng)

    人乳腺癌細(xì)胞MCF-7,用含10%胎牛血清、1%青鏈霉素混合液的DMEM高糖培養(yǎng)基培養(yǎng)于37 ℃、5%CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。細(xì)胞鋪滿培養(yǎng)瓶底80%~90%時(shí)予以胰蛋白酶消化、傳代,約2~3 d傳代1次。

    2.3 CCK8法檢測(cè)人乳腺癌細(xì)胞MCF-7增殖情況

    取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞,用胰蛋白酶消化后收集,用完全培養(yǎng)基調(diào)整細(xì)胞濃度為3×104/mL。從96孔板第2行第2列培養(yǎng)孔開(kāi)始,每列取5孔,取8列,每1列為1組,分別設(shè)為空白對(duì)照組、中藥A組(5 mg/mL)、中藥B組(10 mg/mL)、中藥C組(15 mg/mL)、中藥D組(20 mg/mL)、中藥E組(25 mg/mL)、中藥F組(30 mg/mL)及陽(yáng)性對(duì)照組(注射用鹽酸吡柔比星,參考相關(guān)文獻(xiàn)[4-5]及預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果,濃度設(shè)為10 mg/L)。向每孔中加入100 ?滋L上述細(xì)胞懸液,4周培養(yǎng)孔均加入100 ?滋L磷酸鹽緩沖液,以防邊緣效應(yīng)。將96孔板放于37 ℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)。共接種96孔板3板,分別用于給藥后12、24、48 h檢測(cè)細(xì)胞增殖情況。

    24 h后取出培養(yǎng)板,吸除培養(yǎng)孔中的培養(yǎng)液,并按照分組情況向相應(yīng)列的6個(gè)培養(yǎng)孔加入含相應(yīng)濃度藥物的培養(yǎng)基100 ?滋L,最下方不含細(xì)胞的培養(yǎng)孔作為該組的調(diào)零孔,以排除藥液中色素等對(duì)檢測(cè)結(jié)果的影響。

    給藥后12、24、48 h分別取1塊96孔板,分別向各實(shí)驗(yàn)孔加入CCK8溶液10 ?滋L,輕輕震蕩,使CCK8溶液與培養(yǎng)液混勻,放回培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)2 h后,用酶標(biāo)儀于570 nm波長(zhǎng)下檢測(cè)各孔吸光值(OD值),計(jì)算各孔細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率(IR)。IR(%)=[(空白組OD值-空白調(diào)零孔OD值)-(給藥組OD值-給藥組調(diào)零孔OD值)]/(空白組OD值-空白調(diào)零孔OD值)×100%。

    2.4 流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況

    取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞,調(diào)整濃度為1.5×105/mL,取6孔板2塊,每孔加入上述細(xì)胞懸液2 mL,分別設(shè)為空白組、中藥組(為保證給藥后有足夠細(xì)胞數(shù)用于流式檢測(cè),結(jié)合增殖抑制情況,中藥濃度定為半數(shù)抑制率對(duì)應(yīng)濃度:16 mg/mL)及陽(yáng)性對(duì)照組(注射用鹽酸吡柔比星,因10 mg/L時(shí),細(xì)胞增殖抑制率過(guò)高,為保證給藥后有足夠細(xì)胞數(shù)可用于流式檢測(cè),此處濃度設(shè)為5 mg/L),每組2孔。細(xì)胞鋪板完成后將6孔板置于培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)。

    給藥36 h及48 h后分別取出1塊6孔板,收集各實(shí)驗(yàn)孔中的培養(yǎng)液于15 mL離心管中,以0.25%的胰蛋白酶消化細(xì)胞后,用磷酸鹽緩沖液吹打、收集細(xì)胞,移入離心管,將各組培養(yǎng)液及細(xì)胞懸液均以1 000 r/min轉(zhuǎn)速離心5 min,棄上清。用4 ℃預(yù)冷的磷酸鹽緩沖液清洗細(xì)胞沉淀2次,并合并同組培養(yǎng)液及細(xì)胞懸液離心所得細(xì)胞,1 000 r/min離心5 min,棄上清,用70%冰乙醇固定24 h。1 000 r/min離心5 min,棄上清,磷酸鹽緩沖液洗滌1次,每組加入0.5 mL碘化丙啶染色液,緩慢并充分重懸細(xì)胞沉淀,于37 ℃避光溫浴30 min。染色完成后24 h內(nèi)(期間可以置于4 ℃或冰浴避光存放)用流式細(xì)胞儀在激光波長(zhǎng)488 nm波長(zhǎng)處檢測(cè)熒光強(qiáng)度及散射情況。

    重復(fù)上述步驟3次,取平均值。

    2.5 統(tǒng)計(jì)方法

    采用SPSS 21.0統(tǒng)計(jì)分析軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。計(jì)量資料以“x±s”表示,數(shù)據(jù)符合正態(tài)分布及方差齊性時(shí),兩組間比較采用獨(dú)立樣本T檢驗(yàn),多組間比較采用單因素方差分析,多重比較采用LSD法;數(shù)據(jù)符合正態(tài)分布但方差不齊時(shí),兩組間比較用Satterthwaite近似T檢驗(yàn),多組間比較采用近似T檢驗(yàn)Welch法;數(shù)據(jù)不符合正態(tài)分布,則采用非參數(shù)檢驗(yàn)。計(jì)數(shù)資料以例數(shù)或百分率表示,組間比較采用?字2檢驗(yàn)。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

    3 結(jié)果

    3.1 疏肝健脾解毒方對(duì)MCF-7細(xì)胞增殖的影響

    疏肝健脾解毒方對(duì)MCF-7增殖具有一定的抑制作用,抑制作用具有明顯的濃度依賴性;且12 h至24 h,隨著作用時(shí)間延長(zhǎng),抑制作用明顯增強(qiáng),但24 h至48 h,時(shí)間依賴性不明顯,提示中藥疏肝健脾解毒方對(duì)MCF-7增殖的抑制作用在24 h左右可接近峰值(P<0.05或P<0.01)。較高濃度中藥對(duì)MCF-7增殖抑制作用與陽(yáng)性對(duì)照藥(注射用鹽酸吡柔比星10 mg/L)相當(dāng)(P>0.05)。結(jié)果見(jiàn)表1、圖1。

    3.2 疏肝健脾解毒方對(duì)MCF-7細(xì)胞凋亡的影響

    與空白組比較,中藥組(16 mg/mL)MCF-7細(xì)胞晚期凋亡率較高,且差異有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01),提示中藥疏肝健脾解毒方對(duì)MCF-7細(xì)胞具有誘導(dǎo)凋亡的作用;但中藥組MCF-7細(xì)胞晚期凋亡率低于陽(yáng)性對(duì)照組,且差異有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01),提示中藥疏肝健脾解毒方對(duì)MCF-7的誘導(dǎo)凋亡作用不及陽(yáng)性對(duì)照藥(注射用鹽酸吡柔比星5 mg/L);同組藥物作用后48 h與36 h比較,細(xì)胞凋亡率增加,但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。結(jié)果見(jiàn)表2,圖2。

    4 討論

    乳腺癌,中醫(yī)稱之為“乳巖”“惡瘡” “失榮”等[6]。肝主疏泄,喜條達(dá)而惡抑郁,而乳腺癌患者多為中老年女性,更年期患者多見(jiàn),常為肝郁體質(zhì)[7]。眾多醫(yī)家認(rèn)為,乳腺癌多由郁怒傷肝、肝郁氣滯,又因思慮傷脾、脾失健運(yùn)[8],如明代《外科正宗》中所言:“憂郁傷肝,思慮傷脾,積慮在心,所愿不得者,致經(jīng)絡(luò)痞塞,積聚成核”。故其發(fā)病的關(guān)鍵是情志不遂,肝郁脾虛。肝失疏泄貫穿于乳腺癌發(fā)生發(fā)展的全過(guò)程[9-11]。健脾疏肝法成為治療乳腺癌及其相關(guān)并發(fā)癥的重要治則[12]。我們根據(jù)多年經(jīng)驗(yàn),認(rèn)為肝郁脾虛是乳腺癌發(fā)病的重要原因之一,乳腺與肝、脾、腎及沖任二脈關(guān)系密切,并將乳腺癌的發(fā)生、發(fā)展歸納為“瘀、毒、虛”,即:正氣虧虛, 瘀毒互結(jié)[13]?!笆韪谓∑⒔舛痉健笔俏以褐委熑橄侔┑慕?jīng)驗(yàn)方,方由柴胡、郁金、茯苓、白術(shù)、半枝蓮、白花蛇舌草、蒲公英組成。該方以柴胡、郁金、茯苓、白術(shù)疏肝健脾,白花蛇舌草、半枝蓮、蒲公英清熱解毒。全方藥物配伍精要,疏肝健脾、清熱解毒、扶正抗癌,標(biāo)本兼治。

    本研究用CCK8法驗(yàn)證了疏肝健脾解毒方提取液對(duì)人乳腺癌細(xì)胞MCF-7的抑制作用,發(fā)現(xiàn)其對(duì)MCF-7細(xì)胞的增殖抑制作用較強(qiáng),且藥物濃度、作用時(shí)間均與細(xì)胞增殖抑制率相關(guān)。較高濃度中藥對(duì)MCF-7細(xì)胞的增殖抑制作用與化療藥物(注射用鹽酸吡柔比星10 mg/L)相當(dāng)。同時(shí)用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)了疏肝健脾解毒方提取液對(duì)MCF-7細(xì)胞凋亡的影響。與空白組比較,疏肝健脾解毒方組MCF-7細(xì)胞晚期凋亡率較高,且差異有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01),提示中藥疏肝健脾解毒方對(duì)MCF-7細(xì)胞具有誘導(dǎo)凋亡的作用。因此疏肝健脾解毒方可能通過(guò)誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的方式抑制人乳腺癌細(xì)胞MCF-7增殖。本研究不但可佐證疏肝健脾解毒方的臨床療效確切,也為其在抗乳腺癌作用機(jī)制中的應(yīng)用提供一定的科學(xué)依據(jù)。

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    (本文編輯 楊 瑛)

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