虎杖苷對腎纖維化模型大鼠腎組織中MMP—9和TIMP—1蛋白表達的影響

王松 趙曉玉 梁艷 張英杰 齊躍東

中圖分類號 R285.6 文獻標(biāo)志碼 A 文章編號 1001-0408（2018）07-0936-05

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2018.07.18

摘 要 目的：考察虎杖苷對腎纖維化模型大鼠腎組織中基質(zhì)金屬蛋白酶9（MMP-9）和基質(zhì)金屬蛋白酶組織抑制物1（TIMP-1）蛋白表達的影響，探討其延緩大鼠腎纖維化的作用機制。方法：將40只大鼠隨機分為假手術(shù)組（生理鹽水）、模型組（生理鹽水）、虎杖苷組（100 mg/kg）和貝那普利組（陽性對照，5 mg/kg）。除假手術(shù)組外，其余各組大鼠均采用單側(cè)輸尿管梗阻法制備腎纖維化大鼠模型。術(shù)后1 h，各組大鼠灌胃相應(yīng)藥物，每天給藥1次。連續(xù)給藥4周后，檢測各組大鼠尿液中β2微球蛋白（β2-MG）、N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶（NAG）含量和血清中尿素氮（BUN）、肌酐（Cr）含量；蘇木素-伊紅染色觀察大鼠腎組織病理改變，并進行評分；免疫組織化學(xué)法檢測大鼠腎組織中MMP-9和TIMP-1蛋白表達。結(jié)果：與假手術(shù)組比較，模型組大鼠尿液中β2-MG、NAG含量和血清中BUN、Cr含量均顯著升高（P<0.05），并且大鼠腎組織的病理評分和組織中MMP-9、TIMP-1蛋白的表達水平也顯著升高（P<0.01）。與模型組比較，虎杖苷組和貝那普利組大鼠腎組織中MMP-9蛋白表達水平持續(xù)增高（P<0.01），其余各指標(biāo)水平均顯著降低（P<0.05或P<0.01）；且虎杖苷組與貝那普利組比較大鼠各指標(biāo)水平差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。結(jié)論：虎杖苷延緩大鼠腎纖維化進程的機制可能與上調(diào)大鼠腎組織中MMP-9蛋白表達和下調(diào)TIMP-1蛋白表達，升高MMP-9/TIMP-1的比值有關(guān)。

關(guān)鍵詞 虎杖苷；腎纖維化；單側(cè)輸尿管梗阻；基質(zhì)金屬蛋白酶9；基質(zhì)金屬蛋白酶組織抑制物1

ABSTRACT OBJECTIVE： To investigate the effects of polydatin on protein expression of MMP-9 and TIMP-1 in renal tissue of renal fibrosis model rats， and to investigate the mechanism of delaying renal fibrosis in rats. METHODS： A total of 40 rats were randomly divided into sham operation group （normal saline）， model group （normal saline）， polydatin group （100 mg/kg） and benazepril group （positive control， 5 mg/kg）. Except for sham operation group， renal fibrosis rat model was induced by unilateral ureteral obstruction in other groups. 1 h after surgery， each group was given relevant medicine intragastrically， once a day. After 4 weeks of consecutive treatment， the contents of β2-microglobulin （β2-MG） and N-acetyl-β-D-glucosaminidase （NAG） in urine， serum contents of BUN and Cr were detected in each group. HE staining was used to observe and score pathological changes of renal tissue in rats. Protein expressions of MMP-9 and TIMP-1 in renal tissue of rats were determined by immunohistochemistry. RESULTS： Compared with sham operation group， the contents of β2-MG and NAG in urine， serum contents of BUN and Cr were increased significantly in model group （P<0.05）， and pathological score and protein expressions of MMP-9 and TIMP-1 were also increased significantly （P<0.01）. Compared with model group， protein expression of MMP-9 in renal tissue were increased continuously in polydatin group and benazepril group （P<0.01）； other indexes were decreased significantly （P<0.05 or P<0.01）， and there was no statistical significance in each index between polydatin group and benazepril group （P>0.05）. CONCLUSIONS： Polydatin can delay renal fibrosis， the mechanism of which may be associated with up-regulating protein expression of MMP-9， down-regulating protein expression of TIMP-1 and increasing the ratio of MMP-9/TIMP-1.

KEYWORDS Polydatin； Renal fibrosis； Unilateral ureteral obstruction； MMP-9； TIMP-1

腎纖維化是指細胞外基質(zhì)在腎小管間質(zhì)中的異常沉積，是所有慢性腎病發(fā)展到終末期腎功能衰竭的共同途徑以及終末期腎病的共同病理特點[1-2]。其病變過程非常復(fù)雜，多種細胞、細胞因子、血管活性物質(zhì)和細胞外基質(zhì)等諸多因素相互作用，使細胞外基質(zhì)產(chǎn)生增多或降解減少，最終導(dǎo)致代謝失衡[3]?；⒄溶帐菑霓た浦参锘⒄鹊母稍锔o中提取的一種單體化合物，又稱白藜蘆醇苷，具有抗炎、調(diào)節(jié)免疫、改善糖脂代謝、保護臟器以及治療心血管疾病等作用[4]。有研究顯示，虎杖苷對缺氧復(fù)氧腎小管上皮細胞損傷具有保護作用[5]，且能夠通過抑制氧化應(yīng)激對糖尿病腎病造成的腎小管損傷產(chǎn)生保護作用[6]。這些研究結(jié)果提示虎杖苷對腎疾病具有很好的保護作用。筆者前期研究也顯示，虎杖苷可延緩腎纖維化模型大鼠腎間質(zhì)纖維化的發(fā)生發(fā)展[7]。然而，其作用機制不完全清楚。基質(zhì)金屬蛋白酶9（MMP-9）和基質(zhì)金屬蛋白酶組織抑制物1（TIMP-1）是調(diào)節(jié)細胞外基質(zhì)代謝的重要酶系[8]，二者功能紊亂或調(diào)節(jié)異常參與了腎間質(zhì)纖維化的病變過程。本研究擬通過觀察虎杖苷對腎纖維化模型大鼠腎組織中MMP-9和TIMP-1蛋白的表達，進一步探討虎杖苷延緩大鼠腎纖維化的作用。

1 材料

1.1 儀器

7600型全自動生化分析儀（日本日立公司）；168- 1000xc型酶標(biāo)儀（美國Bio-Rad公司）；BX50型光學(xué)顯微鏡（日本Olympus株式會社）；Lecia型顯微照像系統(tǒng)（德國Leica公司）。

1.2 藥品與試劑

虎杖苷對照品（南京青澤醫(yī)藥科技開發(fā)有限公司，批號：20141106，純度：≥98%）；鹽酸貝那普利片（北京諾華制藥有限公司，批號：X2608，規(guī)格：10 mg/片）；尿素氮（BUN）和肌酐（Cr）測定試劑盒（羅氏診斷有限公司，批號：29646301、28332601）；大鼠β2微球蛋白（β2-MG）、N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶（NAG）酶聯(lián)免疫吸附 （ELISA）試劑盒（武漢華美生物工程有限公司，批號：I21137666、J03137667）；所有抗體均購自北京博奧森生物技術(shù)有限公司；其余試劑均為分析純。

1.3 動物

健康SD大鼠40只，♂，清潔級，鼠齡6周，體質(zhì)量（200±20） g，由河南省實驗動物中心提供[動物生產(chǎn)合格證號：SCXK（豫）2011-0001]。

2 方法

2.1 分組與造模

將40只大鼠隨機分為4組，即假手術(shù)組、模型組、虎杖苷組和貝那普利組，每組10只。模型組、虎杖苷組和貝那普利組大鼠采用單側(cè)輸尿管梗阻（UUO）法[9]復(fù)制腎纖維化模型，即用10%水合氯醛（4 mL/kg）腹腔注射麻醉后，將大鼠右側(cè)臥位固定于手術(shù)臺上，常規(guī)備皮消毒，然后于左側(cè)中腹切開皮膚，逐層分離皮膚、肌肉及腹壁各層，暴露并游離左側(cè)輸尿管，在輸尿管上1/3處和中1/3處分別用絲線結(jié)扎輸尿管，再在兩結(jié)扎點之間剪斷輸尿管，最后逐層縫合。假手術(shù)組大鼠僅打開腹腔和游離左側(cè)輸尿管，不結(jié)扎、不切斷。

2.2 給藥

手術(shù)完成后1 h開始給藥，虎杖苷組大鼠灌胃虎杖苷100 mg/kg （預(yù)實驗結(jié)果顯示，100 mg/kg為改善腎纖維模型大鼠腎功能的最佳劑量），貝那普利組大鼠灌胃給予5 mg/kg貝那普利（生理鹽水溶解，根據(jù)成人臨床用量換算而得），模型組和假手術(shù)組大鼠灌胃等體積的生理鹽水。每天給藥1此，連續(xù)給藥4周。

2.3 標(biāo)本采集及處理

末次灌胃后將大鼠置于潔凈代謝籠內(nèi)，收集24 h尿液。24 h后將所有大鼠麻醉，眼眶后靜脈叢取血2 mL，以離心半徑15 cm、3 000 r/min離心15 min，取上清液。處死大鼠后取出輸尿管結(jié)扎側(cè)的腎組織，4%多聚甲醛固定，常規(guī)石蠟包埋，4 ℃冰箱中保存，備用。

2.4 尿液中β2-MG和NAG含量測定

采用雙抗夾心ELISA法，按照試劑盒說明書操作測定各組大鼠尿液中β2-MG和NAG的含量。

2.5 血清中BUN和Cr含量檢測

采用全自動生化分析儀測定各組大鼠血清中BUN和Cr含量。

2.6 腎組織病理評分

將蠟塊制成4 μm厚的切片，行蘇木精-伊紅（HE）染色，然后于光學(xué)顯微鏡下觀察其病理變化，并按照Banff分級進行評分[10]：0分表示腎組織無腎小管擴張、萎縮、壞死等病理變化；1分表示輕度損傷，即腎小管間質(zhì)病變范圍<25%；2分表示中度損傷，即腎小管間質(zhì)病變范圍為26%～50%；3分表示嚴(yán)重損傷，即腎小管間質(zhì)病變范圍>50%。每只大鼠取3張切片，每張切片隨機選取5個高倍視野（×400）。

2.7 腎組織中MMP-9和TIMP-1蛋白表達測定

取石蠟切片，采用生物素蛋白-過氧化物酶（SP）免疫組織化學(xué)法進行測定。切片常規(guī)脫蠟水化，用磷酸鹽緩沖液（PBS）漂洗3遍，檸檬酸抗原修復(fù)10 min，自然冷卻，PBS漂洗3遍，用含3%H2O2的去離子水室溫孵育20 min，PBS漂洗3遍，滴加封閉用正常山羊血清工作液，37 ℃孵育20 min，棄去多余液體；然后滴加MMP-9、TIMP-1一抗（1 ∶ 150），4 ℃過夜，PBS漂洗3遍；然后滴加山羊抗兔二抗工作液，37 ℃孵育30 min，PBS漂洗3遍；滴加辣根酶標(biāo)記鏈酶卵白素工作液，37 ℃孵育30 min，PBS漂洗3遍；3，3′ -二氨基聯(lián)苯胺四鹽酸鹽（DAB）顯色，顯微鏡下控制顯色時間（2～3 min），蘇木素復(fù)染5 min，鹽酸乙醇分化，自來水充分沖洗，脫水、透明、封片、鏡檢。以胞漿呈棕黃色為陽性表達，用Biosens Digital Imaging System v1.6圖像分析軟件測定每個高倍視野（×400）下陽性染色細胞的平均積分光密度值。

2.8 統(tǒng)計學(xué)分析

采用SPSS 17.0軟件進行統(tǒng)計分析。數(shù)據(jù)以x±s表示，多組間比較采用單因素方差分析，若方差齊時組間兩兩比較采用LSD-t檢驗；方差不齊時采用Dunnetts T3檢驗。P<0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 尿液中β2-MG和NAG含量測定結(jié)果

與假手術(shù)組比較，模型組大鼠尿液中β2-MG和NAG含量顯著升高（P<0.01）。與模型組比較，虎杖苷組和貝那普利組大鼠尿液中β2-MG和NAG含量均顯著降低（P<0.05），且虎杖苷組與貝那普利組大鼠尿液中β2-MG和NAG含量差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05），結(jié)果見表1。

3.2 血清中BUN和Cr含量測定結(jié)果

與假手術(shù)組比較，模型組大鼠血清中BUN和Cr含量顯著升高（P<0.01）；與模型組比較，虎杖苷組和貝那普利組大鼠血清中BUN和Cr含量均顯著降低（P<0.05或P<0.01），且虎杖苷組與貝那普利組大鼠血清中BUN和Cr含量差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05），結(jié)果見表2。

3.3 腎組織病理評分結(jié)果

與假手術(shù)組比較，模型組大鼠腎組織病理評分顯著升高（P<0.01）。與模型組比較，虎杖苷組和貝那普利組大鼠腎組織病理評分顯著降低（P<0.01），且虎杖苷組和貝那普利組大鼠腎組織病理評分差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。假手術(shù)組、模型組、虎杖苷組和貝那普利組大鼠腎組織病理評分依次為0.07±0.15、1.99±0.44、1.31±0.41、1.25±0.31（n=10）。

3.4 腎組織中MMP-9和TIMP-1蛋白表達測定結(jié)果

與假手術(shù)組比較，模型組大鼠腎組織中MMP-9和TIMP-1蛋白表達水平顯著升高（P<0.01）。與模型組比較，虎杖苷組和貝那普利組大鼠腎組織中MMP-9蛋白表達水平持續(xù)升高（P<0.01），而TIMP-1蛋白表達水平則顯著降低（P<0.05）；但虎杖苷組與貝那普利組大鼠腎組織中MMP-9和TIMP-1蛋白表達水平差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05），免疫組化圖見圖1，測定結(jié)果見表3。

4 討論

UUO動物模型通過結(jié)扎單側(cè)輸尿管，阻塞腎臟引流系統(tǒng)，從而引起腎功能急性改變以及腎結(jié)構(gòu)慢性損傷，其結(jié)果與梗阻性腎病患者的觀察結(jié)果相似[11]，是一種研究腎纖維化發(fā)病機制、腎細胞轉(zhuǎn)分化和評價腎纖維化治療方法的理想模型。在本研究中，HE染色后可見模型組大鼠腎間質(zhì)區(qū)域有大量膠原纖維沉積，腎間質(zhì)纖維化明顯，腎組織病理評分顯著高于正常組，這個結(jié)果與大鼠血清中BUN和Cr含量顯著升高相對應(yīng)，提示造模成功。給予虎杖苷后，大鼠腎間質(zhì)纖維化程度減輕，病理評分和血清中BUN、Cr含量較模型組大鼠均顯著降低，且與貝那普利組大鼠比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義。貝那普利是經(jīng)典的血管緊張素轉(zhuǎn)化酶抑制劑，其可延緩人及動物模型的腎小球硬化和小管間質(zhì)纖維化進展的作用已得到廣泛公認(rèn)[12]，故在本研究中以其為陽性對照藥。

β2-MG作為一種小分子球蛋白，在正常人體內(nèi)的生成和釋放速度十分恒定，并且能自由通過腎小球濾過膜，原尿中99.9%的β2-MG被近曲小管重吸收和降解，因此正常人體尿液中β2-MG含量極低[13]。一旦腎小管功能受到輕微損傷，對β2-MG的重吸收功能下降，便可引起尿液中β2-MG含量的增高。尿液中β2-MG已被視為腎小管經(jīng)典標(biāo)記蛋白，與腎小管功能緊密相連[14]。NAG是位于溶酶體中的一種酸性水解酶，腎組織是合成和儲存NAG的主要器官，尤其以腎組織的近曲小管內(nèi)含量最多，由于血漿中的NAG不能被腎小球濾過，NAG都是從尿中直接排出。正常尿液中NAG的含量保持恒定，但當(dāng)缺血、缺氧、中毒等多種因素引起近曲小管功能被破壞時，尿液中NAG含量將顯著升高，這預(yù)示著近曲小管上皮細胞受損，溶酶體破裂釋放了NAG。因此，尿液中NAG含量是監(jiān)測早期腎損傷與病程觀察的敏感且特異的指標(biāo)[15]。在本研究中，模型組大鼠尿液中β2-MG和NAG含量較假手術(shù)組均顯著升高，而虎杖苷組大鼠尿液中β2-MG和NAG含量較模型組顯著降低，且與貝那普利組大鼠比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義。

MMPs是一類高度保守的依賴于鋅離子和鈣離子的內(nèi)切蛋白水解酶家族，能降解纖維連接蛋白、粘連蛋白和Ⅳ型膠原蛋白等構(gòu)成細胞外基質(zhì)的多種成分[16]。MMP-9又稱明膠酶，是調(diào)節(jié)細胞外基質(zhì)動態(tài)平衡的重要酶類，主要在腎小球、近曲小管、髓袢、集合管表達[16]，主要降解明膠、Ⅳ和Ⅴ型膠原及層粘連蛋白等，是細胞外基質(zhì)蛋白降解酶之一，能夠降解完整的基底膜[17]。TIMPs是MMPs的特異性抑制劑，在腎間質(zhì)纖維化過程中，細胞外基質(zhì)的過度累及與MMPs/TIMPs的比例失衡有關(guān)[16]。在腎間質(zhì)纖維化過程中，TIMP-1過度表達，通過抑制MMP-9活性使MMP-9失去降解細胞外基質(zhì)的能力，造成細胞外基質(zhì)過度堆積，最終因MMP-9/TIMP-1比例失衡而導(dǎo)致腎纖維化[18]。本研究結(jié)果顯示，模型組大鼠腎組織中MMP-9蛋白表達水平升高；經(jīng)虎杖苷治療后大鼠腎組織中MMP-9蛋白表達水平?jīng)]有出現(xiàn)下降趨勢，而是維持在較高水平，但是TIMP-1蛋白的表達水平較模型組顯著降低。相關(guān)研究認(rèn)為，MMPs具有雙重作用，既可以作為抗纖維化的酶又是前炎癥介質(zhì)，在腎病中具體發(fā)揮哪種作用取決于MMPs的凈活性和發(fā)病的急緩[19]。鄧順有等[20]認(rèn)為通過調(diào)控MMPs/TIMPs系統(tǒng)，上調(diào)MMPs蛋白表達，下調(diào)TIMPs蛋白表達，升高MMPs/TIMPs比值，能夠促進細胞外基質(zhì)降解?？傊I組織中MMP-9蛋白表達水平升高，將有助于清除產(chǎn)生過多的細胞外基質(zhì)，是腎纖維化的一種自身抑制反應(yīng)；而TIMP-1蛋白表達水平升高則可拮抗MMP-9的活性，導(dǎo)致細胞外基質(zhì)降解減少。

綜上所述，虎杖苷可通過上調(diào)腎組織中MMP-9蛋白的表達，同時下調(diào)腎組織中TIMP-1蛋白的表達，使MMP-9/TIMP-1的失衡狀態(tài)得以恢復(fù)，從而使過度沉積的細胞外基質(zhì)降解，進而延緩腎纖維化的進程，本研究結(jié)果為中藥防治腎纖維化提供了新的思路。

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（收稿日期：2017-09-06 修回日期：2018-01-30）

（編輯：林 靜）