HPSEC—ELSD法同時測定白及多糖的分子量和含量

王川 張燕 李楠 李雅麗 劉江云 蔡培烈 郝麗莉

中圖分類號 R284.1；R917 文獻標志碼 A 文章編號 1001-0408（2018）09-1198-04

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2018.09.11

摘 要 目的：建立同時測定白及多糖的分子量及其含量的方法。方法：采用高效分子排阻色譜-蒸發(fā)光散射檢測（HPSEC-ELSD）法。色譜柱為TSK-GEL G4000 PWXL，流動相為純水，流速為0.6 mL/min，柱溫為30 ℃，進樣量為20 μL，采用蒸發(fā)光散射檢測器。采用建立的方法測定3批白及多糖的分子量及其含量。結(jié)果：白及多糖的重均分子量測定線性范圍為24.17～178.00 kD（R2=0.985 5），BT07含量測定線性范圍為0.508 0～5.080 mg/mL（R2=0.998 4），檢測限、定量限分別為0.116 5 、0.274 0 mg/mL，精密度、穩(wěn)定性、重復(fù)性試驗的RSD 均<2%（n=6或n=7）；白及多糖樣品含量測定平均加樣回收率為99.16%～100.20%（RSD=0.39%～0.64%，n=9）。3批樣品的平均保留時間為14.28 min （RSD=4.35%，n=3），平均重均分子量為23.54 kD（RSD=3.78%，n=3），多分散系數(shù)（D，MW/Mn）范圍為1.463～1.578，樣品平均含量為93.4%（RSD=4.22%，n=3）。結(jié)論：建立的HPSEC-ELSD法操作簡便 、快速，結(jié)果準確可靠，可同時測定白及多糖的分子量和含量。

關(guān)鍵詞 白及；多糖；高效分子排阻色譜-蒸發(fā)光散射檢測法；分子量；含量

ABSTRACT OBJECTIVE： To set up a method for determination of molecular weight and content of polysaccharide in Bletilla striata. METHODS： HPSEC-ELSD method was adopted. The determination was performed on TSK-GEL G4000 PWXL column with mobile phase consisted of pure water at the flow rate of 0.6 mL/min. The column temperature was 30 ℃， and sample size was 20 μL. Evaporative light scattering detector was used. The molecular weight and content of polysaccharide in 3 batches of B. striata were established. RESULTS： The linear range of weight average molecular weight of B. striata polysaccharide were 24.17-178.00 kD（R2=0.985 5）. The linear range of BT07 content determination were 0.508 0-5.080 mg/mL（R2=0.998 4）. The limits of detection and quantitation were 0.116 5 and 0.274 0 mg/mL. RSDs of precision， stability and reproducibility tests were all lower than 2% （n=6 or n=7）. Average recoveries rate were 99.16%-100.20% （RSD=0.39%-0.64%，n=9）. Average retention time of 3 batches of samples was 14.28 min （RSD=4.35%， n=3）， and weight average molecular weight was 23.54 kD （RSD=3.78%，n=3）. Polydispersity coefficient D，MW/Mn）ranged 1.463-1.578. Average content of sample was 93.4% （RSD=4.22%， n=3）. CONCLUSIONS： HPSEC-ELSD method is simple， rapid， accurate and reliable， which can be used for simultaneous determination of B. striata polysaccharide.

KEYWORDS Bletilla striata； Polysaccharide； HPSEC-ELSD； Molecular weight； Content

多糖是自然界生物中廣泛分布、用途廣泛的一類高分子聚合物，同時也是靈芝、鐵皮石斛、黃精、枸杞子等眾多常用中藥的有效成分之一[1]。由于多糖的結(jié)構(gòu)復(fù)雜而且存在微觀不均一性，其分子量及其分布主要采用高效分子排阻色譜（HPSEC）法測定[2]。由于糖類分子結(jié)構(gòu)中缺乏發(fā)色團，常規(guī)采用間接方法例如多糖經(jīng)完全酸水解、衍生化反應(yīng)后再選用比色法、氣相法、液相法等對其單糖組成和含量進行測定。中藥白及[Bletilla striata（Thunb.）Reichb. f.]藥用部位為其塊莖，具有收斂止血、補肺、消腫生肌之功效，用于咯血、吐血、外傷出血、皮膚皴裂等病癥。白及中含有多種特征性的菲類衍生物、有機酚酸等復(fù)雜成分和多糖，其中白及多糖是其主要有效成分之一[3-4]。白及多糖的含量測定常規(guī)選用比色法，但該法測定的是總糖含量，不能區(qū)別單糖和多糖純度[5-6]。本課題組曾選用示差檢測器，采用HPSEC法可以直接同時測定白及多糖分子量及其含量[7]，但該檢測器靈敏度相對較低，檢測時容易受到流動相組成、柱溫、樣品中其他雜質(zhì)等干擾。為此，本文參考相關(guān)文獻[8-12]，采用HPSEC聯(lián)用蒸發(fā)光散射檢測器（ELSD）法進一步優(yōu)化測定白及多糖的分子量及其含量的方法，為其質(zhì)量控制方法提供參考。

1 材料

1.1 儀器

LC-20A高效液相色譜儀（日本島津公司）； 2000 ELSD（美國奧泰公司）；EC2000 GPC軟件（大連依利特分析儀器有限公司）；XWK-3A空氣泵（天津市華生分析儀器廠）；ME215S電子天平（德國Starorious公司）；MP2002電子天平（上海舜宇恒平科學(xué)儀器有限公司）。

1.2 藥品與試劑

已知分子量的白及多糖BT01～BT07 7個對照品（本實驗室自制，純度：均>95%），其分子量參數(shù)重均分子量（MW）、數(shù)均分子量（Mn）、多分散系數(shù)（D，MW/Mn）采用多角激光光散射法測定（表1）[7，13]；葡聚糖T-2000（批號：17-0330-01，純度：95.4%）購自北京拜爾迪生物公司。無水葡萄糖（批號：20130111，分析純，純度：98.2%）購自上海國藥集團化學(xué)試劑有限公司；水為純水；白及根莖（批號：BS171001）購自云南普洱市玉林林業(yè)開發(fā)有限公司。白及多糖試制樣品BP-1～BP-3（批號：BP171001、BP171101、BP171102），由本實驗室自制[13]。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱：TSK- GEL G4000 PWXL（300 mm×7.8 mm，10 μm）；流動相：純水；流速：0.6 mL/min；柱溫：30 ℃；進樣量：20 μL；ELSD檢測器。

2.2 溶液的制備

2.2.1 對照品溶液 精密稱取白及多糖對照品BT01～BT07、葡聚糖T-2000、葡萄糖各10 mg，置于10 mL量瓶中，用水加熱溶解，定容，即得。精密稱取BT07對照品101.61 mg，置于20 mL量瓶中，用適量水加熱溶解，定容，即得BT07貯備液（5.080 mg/mL）。

2.2.2 供試樣品 取白及藥材（100 g）于沸水中回流提取1.5 h（1 L×2），加入兩倍無水乙醇使沉淀，抽濾，干燥，得白及多糖提取物（15.6 g）。取所得白及多糖（2.0 g）溶于96 mL水中，加入4 mL 0.10 mol/L 鹽酸，于90 ℃水浴恒溫酸水解3.5 h，用1 mol/L 氫氧化鈉調(diào)pH至6～7，過濾，濾液加入200 mL無水乙醇使沉淀，抽濾，60 ℃干燥，得白及多糖試樣BP-1（1.24 g）。同法制備獲得試樣BP-2和BP-3。

2.2.3 供試品溶液 精密稱取試樣BP-1～BP-3各約20 mg，置于10 mL量瓶中，分別加入適量水加熱溶解，定容，即得。

2.3 系統(tǒng)適用性試驗

根據(jù)分子排阻色譜的要求，測定樣品的保留時間應(yīng)在最大分子量和最小分子量對照品之間；應(yīng)選擇與測定樣品結(jié)構(gòu)和分子量最相近的對照品[2]。在此色譜條件下，測定葡聚糖T-2000、葡萄糖的保留時間（tR）分別為8.38、17.54 min，葡萄糖理論板數(shù)為5 685。系列白及多糖對照品tR值均在該范圍內(nèi)，方法可行。代表性對照品BT07與樣品BP-1的色譜圖見圖1。

2.4 線性關(guān)系考察

2.4.1 分子量線性關(guān)系的建立 吸取“2.2.1”項下BT01～BT07對照品溶液，按“2.1”項下色譜條件進樣，記錄色譜峰tR，結(jié)果見表1。以tR為橫坐標，對照品Mw的對數(shù)值（lgMw）為縱坐標，計算回歸方程為lgMw=-0.224 4tR+4.574 9（R2=0.985 5）。結(jié)果表明，在該色譜條件下白及多糖分子量線性關(guān)系良好（Mw 24.17～178.0 kD）。

2.4.2 BT07含量線性關(guān)系 精密量取BT07貯備液（5.080 mg/mL）0.5、1.0、2.0、3.0、4.0 mL，分別置于5 mL量瓶中，用水稀釋至刻度，按“2.1”項下色譜條件分別進樣，記錄色譜峰面積A。以質(zhì)量濃度的對數(shù)值為橫坐標（x），以峰面積A的對數(shù)值為縱坐標（y）進行線性回歸，獲得兩者之間的線性回歸方程為y=1.492 4x+0.748 2（R2=0.998 4）。結(jié)果表明，BT07在該色譜條件下含量與峰面積線性關(guān)系良好，線性范圍為0.508 0～5.080 mg/mL。

2.5 檢測限與定量限考察

取“2.4.2”項下BT07對照品溶液（1.016、2.032、3.048、4.064 mg/mL）各0.5 mL，分別置于5 mL量瓶中，用水稀釋至刻度，制得一系列質(zhì)量濃度BT07溶液，按“2.1”項下色譜條件進樣分析，記錄色譜峰峰高H。當(dāng)信噪比為3 ∶ 1時，得檢測限質(zhì)量濃度為0.116 5 mg/mL；當(dāng)信噪比為10 ∶ 1時，得定量限質(zhì)量濃度為0.274 0 mg/mL。

2.6 精密度試驗

取“2.2.1”項下BT07對照品溶液適量，按“2.1”項下色譜條件重復(fù)進樣6次，記錄色譜峰tR和峰面積A。計算得到BT07平均tR為 14.28 min（RSD=0.54%，n=6），平均A為1.314×107（RSD=1.67%，n=6）。結(jié)果表明，該法精密度良好。

2.7 穩(wěn)定性試驗

取BP-1供試品溶液，分別于室溫放置0、2、4、6、8、10、12 h時，按“2.1”項下色譜條件進樣分析，記錄色譜峰tR、峰面積A。計算得到BP-1平均tR為 14.25 min（RSD=0.94%，n=7），平均A為1.345×107（RSD=1.69%，n=7）。結(jié)果表明，該法12 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.8 重復(fù)性試驗

取BP-1供試品，共6份，按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，再按“2.1”項下色譜條件進樣測定，記錄色譜峰tR、峰面積A。計算得到BP-1平均tR為14.22 min（RSD=0.83%，n=6），平均A值為1.392×107（RSD=1.41%，n=6）。結(jié)果表明，該法重復(fù)性良好。

2.9 加樣回收率試驗

分別精密稱取10 mg BP-1供試品9份，加入到5 mL量瓶中，再精密加入配制好的BT07對照品溶液（10.05 mg/mL）0.5、1.0、1.5 mL各3份，加入適量水加熱溶解，定容。按“2.1”項下色譜條件進樣分析，并計算加樣回收率。結(jié)果表明，低、中、高3種加入量的回收率分別為99.16%、100.20%、99.91%，RSD分別為0.64%、0.64%、0.39%（n=3），見表2。

2.10 樣品測定

取BP-1～BP-3共3批次樣品，按“2.2.3”項下方法制備供試品溶液，再按“2.1”項下色譜條件進樣測定，記錄色譜峰保留時間tR、峰面積A，計算各批次樣品的MW和含量。結(jié)果，BP-1～BP-3樣品的平均tR為14.28 min（RSD=4.35%，n=3），平均MW為23.54 kD（RSD=3.78%，n=3），D值范圍1.463～1.578，樣品平均含量為93.4%（RSD=4.22%，n=3）。表明所建立的分析方法適用于該樣品分子量和含量分析。

3 討論

ELSD是一種通用性質(zhì)量分析檢測器，具有穩(wěn)定性好、特異性強、靈敏度高等優(yōu)點，流動相可以進行梯度洗脫，尤其適用于復(fù)雜多組分的分析[14-16]。近年來，HPSEC色譜在麥冬、甘草等植物多糖的定性定量分析中也獲得成功應(yīng)用[8-12]。本文研究結(jié)果表明，該法可直接測定白及多糖分子量及其含量，同時不同分子量規(guī)格的多糖也可獲得有效分離，方法簡便、快捷，準確度高，適用于白及多糖的分析。

對缺乏紫外特征吸收的糖和苷類等成分分析，常規(guī)可選用示差檢測器和ELSD等質(zhì)量型檢測器。傳統(tǒng)糖類檢測中使用的示差檢測器容易受環(huán)境溫度、流動相組成、柱溫、樣品中其他雜質(zhì)等干擾。故本試驗中，采用ELSD法對白及多糖進行檢測，檢測限為0.116 5 mg/mL，比前期所用的示差檢測器檢測限（1.133 mg/mL）[5]約高10倍，表明本法靈敏度較高，在應(yīng)用于生物樣品分析中具有一定優(yōu)勢。此外，HPSEC分析方法中所用色譜柱的適用分子量測定范圍、樣品濃度、流動相選擇等影響因素也很重要，應(yīng)在方法學(xué)研究中進行考察和優(yōu)化。

綜上，本研究建立的方法操作簡便 、快速，結(jié)果準確可靠，可同時測定白及多糖的分子量和含量。

參考文獻

[ 1 ] 國家藥典委員會.中華人民共和國藥典：一部[S]. 2015年版.北京：中國醫(yī)藥科技出版社，2015：188-189、249、282-283、306-307.

[ 2 ] 國家藥典委員會.中華人民共和國藥典：四部[S]. 2015年版.北京：中國醫(yī)藥科技出版社，2015：62-63.

[ 3 ] 萬大群，趙仁全，劉海，等.白及的成分、藥理作用和臨床應(yīng)用研究進展[J].中國藥業(yè)，2017，26（2）：93-96.

[ 4 ] HE X，WANG X，F(xiàn)ANG J，et al. Bletilla striata：medicinal uses，phytochemistry and pharmacological activities[J]. J Ethnopharmacol，2017，195（1）：20-38.

[ 5 ] 陶平德，常明泉，李德福，等.蒽酮-硫酸法測定復(fù)方白及乳膏中白及多糖的含量[J].兒科藥學(xué)雜志，2012，18（9）：40-43.

[ 6 ] 劉福強，王艷萍，韓丹，等.白及多糖的提取及其相對分子質(zhì)量測定和結(jié)構(gòu)研究[J].中成藥，2013，35（10）：2291- 2293.

[ 7 ] 李楠，李卓，張燕，等.高效分子排阻色譜法同時測定白及多糖分子量和含量[J].藥物分析雜志，2012，32（10）：1801-1803.

[ 8 ] KAZ?OWSKI B，KAZ?OWSKA K，PAN CL，et al. Evaluation of HPSEC-ELSD method for precise measurement of β-agarase activity [J]. Biomed Chromatogr，2011，25（5）：570-578.

[ 9 ] 羅立梅，陳朝銀，李時琪，等.高效液相色譜-蒸發(fā)光散射法測定皂莢殼多糖的單糖組分及其含量[J].理化檢驗：化學(xué)分冊，2013，49（3）：270-273.

[10] 胡坪，喬晚芳，王楠，等.麥冬多糖相對分子質(zhì)量測定方法的研究[J].中成藥，2013，35（12）：2684-2689.

[11] 趙穎，宋新波，張麗娟，等.高效凝膠色譜法測定甘草多糖分子量及其分子量分布[J].天津中醫(yī)藥，2015，32（1）：46-48.

[12] PATEL SG，BUMMER PM. Development of a robust me- thod for simultaneous quantification of polymer （HPMC） and surfactant （dodecyl β-D-maltoside） in nanosuspensions[J]. AAPS PharmSciTech，2016，17（5）：1182-1191.

[13] 張燕，米銀花，殷殷，等.白及多糖Mark-Houwink方程的建立[J].蘇州大學(xué)學(xué)報（自然科學(xué)版），2010，26（4）：80-83.

[14] 朱曉璐，林昀，李霞.蒸發(fā)光散射-HPLC法測定硫酸妥布霉素注射液中的有關(guān)物質(zhì)[J].中國藥房，2012，23（16）：1527-1528.

[15] 馬涵濤，沈新倫，杜雄軍. HPLC-ELSD法測定補心氣口服液中黃芪甲苷的含量[J].中國藥房，2012，23（36）：3444-3445.

[16] 魏曉雨，姜國棟，陳泓，等.貞芪扶正顆粒的HPLC指紋圖譜研究[J].中國藥房，2017，28（33）：4691-4694.

（收稿日期：2018-02-06 修回日期：2018-03-15）

（編輯：余慶華）