富氫鹽水抑制大鼠壓瘡深部骨骼肌NLRP3炎性小體活化

陳曉偉，張紅英，劉 靜

壓瘡(pressure ulcer)是長期臥床患者常見并發(fā)癥。局部組織長時(shí)間擠壓導(dǎo)致供血障礙，擠壓解除后供血恢復(fù)導(dǎo)致形成再灌注病理改變，反復(fù)的缺血再灌注損傷導(dǎo)致皮膚及骨骼肌細(xì)胞凋亡、組織壞死。研究表明，壓瘡發(fā)生起始于深層骨骼肌，繼而發(fā)展至表層皮膚，骨骼肌缺血再灌注損傷程度決定了壓瘡的病理進(jìn)程[1]。骨骼肌成為治療壓瘡的關(guān)鍵靶器官。炎性反應(yīng)是骨骼肌缺血再灌注損傷的重要病理機(jī)制之一[2]。NLRP3炎性小體(NLRP3 inflammasome)在免疫應(yīng)答和炎性反應(yīng)中發(fā)揮重要作用，由NOD樣受體、凋亡相關(guān)斑點(diǎn)樣蛋白(ASC)及天冬氨酸特異性半胱氨酸蛋白酶-1(caspase-1)共同組成。Stojadinovic等[3]證明，壓瘡深部骨骼肌NLRP3炎性小體各組件蛋白表達(dá)明顯升高。提示NLRP3炎性小體參與了壓瘡的病理改變。

氧化應(yīng)激是NLRP3炎性小體的重要活化機(jī)制[4]。氫分子具有很強(qiáng)的還原活性，可選擇性抑制亞硝酸陰離子、羥自由基等活性氧(reactive oxygen species, ROS)成員的活性。研究表明，富氫鹽水可有效抑制心、肺、肝、腎、腦等臟器缺血再灌注損傷[5]。Huang等[6]利用止血帶制備骨骼肌缺血再灌注模型，發(fā)現(xiàn)再灌注前腹腔注射富氫鹽水顯著抑制骨骼肌細(xì)胞凋亡。本研究擬觀察富氫鹽水對壓瘡深部骨骼肌NLRP3炎性小體的干預(yù)效果，以探討富氫鹽水用于壓瘡治療的可能性。

1 材料與方法

1.1 材料 健康雄性SD大鼠30只，購于軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院動物中心，體重(209.2±18.6) g。適應(yīng)性飼養(yǎng)階段，動物自由進(jìn)食水，相對濕度45%～65%，溫度(22±1)℃，12 h光照。大鼠飼養(yǎng)和干預(yù)均符合實(shí)驗(yàn)動物倫理學(xué)要求。

1.2 動物分組與造模 采用隨機(jī)數(shù)字表法，大鼠分為3組：對照組(Control group, C)、壓瘡+生理鹽水組(Pressure ulcer + saline group，PU+S)和壓瘡+富氫鹽水組(Pressure ulcer + hydrogen-rich saline group，PU +HS)，每組10只。PU+S和PU+HS組大鼠參照文獻(xiàn)[7]方法制備雙側(cè)股薄肌壓瘡模型。壓瘡模型建立成功后，PU+HS組大鼠每日腹腔注射飽和富氫鹽水(氫氣濃度0.6 mmol /L，10 ml/kg體重)一次，連續(xù)5 d。PU+HS組大鼠每日腹腔注射生理鹽水(10 ml/kg體重)，連續(xù)5 d。對照組正常進(jìn)食水，不予任何處理。各組大鼠均于末次腹腔注射后24 h斷頭處死，分離雙側(cè)股薄肌用于指標(biāo)檢測。

1.3 指標(biāo)檢測 (1)參照試劑盒(南京建成生物工程研究所)說明書操作，采用硫代巴比妥酸比色法，于紫外分光光度計(jì)測定反應(yīng)體系吸光度值，計(jì)算骨骼肌組織丙二醛(MDA)含量(nmol/mg pro)。(2)參照大鼠骨骼肌組織IL-1β定量酶聯(lián)檢測試劑盒(上海碧云天生物技術(shù)有限公司)說明書操作，采用ELISA法，于熒光酶標(biāo)儀測定各組骨骼肌組織IL-1β含量(pg/mg pro)。(3)參照試劑盒(南京建成生物工程研究所)說明書操作，采用熒光光分光光度法，于熒光酶標(biāo)儀測定反應(yīng)體系熒光強(qiáng)度。C組骨骼肌組織Caspase-1活性定義為1，PU+S和PU+HS組Caspase-1活性為與C組比較的相對活性。

1.4 骨骼肌組織NLRP3和ASC蛋白表達(dá) Western blot法檢測，以β-actin為內(nèi)參。包含10 μg骨骼肌的組織勻漿與SDS上樣緩沖液混合加熱處理5 min，上樣后經(jīng)SDS-PAGE電泳分離，濕轉(zhuǎn)法轉(zhuǎn)移至PVDF膜，對應(yīng)一抗振蕩孵育12 h，PBS洗凈后用辣根過氧化物酶標(biāo)記二抗靜置孵育1 h，PBS洗凈后用顯色試劑盒顯影，X-ray膠片曝光記錄。掃描條帶灰度值，C組條帶灰度值定義為100%，PU+S和PU+HS組為與C組比較的相對表達(dá)量。

2 結(jié) 果

2.1 對壓瘡深部骨骼肌MDA 、IL-1β含量和Caspase-1活性的影響 與C組比較，PU+S組MDA 、IL-1β含量和Caspase-1活性均顯著升高(P<0.01)，PU+HS組IL-1β含量顯著升高(P<0.05)。PU+HS組與PU+S組比較，Caspase-1活性、MDA和IL-1β含量顯著降低(P<0.01，表1)。

表1實(shí)驗(yàn)鼠各組骨骼肌MDA、IL-1β含量和Caspase-1活性的變化

組別MDA(nmol/mg pro)Caspase-1 activity (Fold Change)IL-1β levels(pg/mL)C組13.15±1.931.00±0.230.47±0.07PU+S組27.40±4.42②1.42±0.35②1.05±0.19②PU+HS組14.92±3.11④1.13±0.25③0.69±0.18①④

注：C代表對照組，PU+S代表壓瘡+生理鹽水組，PU+HS代表壓瘡+富氫鹽水組。與C組比較，①P<0.05, ②P<0.01；與PU+S組比較，③P<0.05, ④P<0.01

2.2 對壓瘡深部骨骼肌NLRP3和ASC蛋白表達(dá)的影響 與C組比較，PU+S組NLRP3蛋白表達(dá)顯著升高(178.49±18.62vs100.00±10.07，P<0.01)，PU+HS組NLRP3蛋白表達(dá)升高(122.29±19.96vs100.00±10.07，P<0.05)。PU+HS組NLRP3蛋白表達(dá)低于PU+S組(P<0.01)(圖1A)。與C組比較，PU+S組ASC蛋白表達(dá)顯著升高(129.47±18.62vs100.00±12.92，P<0.01)，PU+HS組ASC蛋白表達(dá)無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(105.33±16.67vs100.00±12.92，P<0.05)。PU+HS組ASC蛋白表達(dá)低于PU+S組(P<0.01)(圖1B)。

圖1 實(shí)驗(yàn)大鼠各組骨骼肌蛋白表達(dá)的變化

3 討 論

氧化應(yīng)激與諸多疾病發(fā)生密切相關(guān)，富氫鹽水因其抗氧化特質(zhì)受到研究者的關(guān)注。研究表明，大鼠腹腔注射富氫鹽水1 h后，血漿氫分子濃度可達(dá)到μM水平，MDA含量顯著下降，是一種有效的氫分子抗氧化給藥模式[8]。本研究中，連續(xù)腹腔注射富氫鹽水5 d可顯著降低壓瘡深層股薄肌MDA含量。氧化應(yīng)激水平受到ROS產(chǎn)生和抗氧化酶活性的共同影響，MDA是生物膜脂類過氧化最主要的產(chǎn)物，可反映機(jī)體氧化應(yīng)激水平。研究表明，氫可選擇性與強(qiáng)氧化性ROS直接發(fā)生還原反應(yīng)[5]。此外，Meng等[9]研究證明，富氫鹽水可激活轉(zhuǎn)錄因子Nrf2，后者可促進(jìn)SOD、HO-1等一系列內(nèi)源性抗氧化酶表達(dá)。以上提示，富氫鹽水可有效抑制壓瘡導(dǎo)致的骨骼肌氧化應(yīng)激。

IL-1β是炎性反應(yīng)中重要的促炎細(xì)胞因子之一，以無活性前體形式合成并存在，在IL-1β轉(zhuǎn)化酶催化水解反應(yīng)后轉(zhuǎn)化為具有促炎效應(yīng)的成熟IL-1β。免疫組化結(jié)果顯示，壓瘡表層皮膚及深層肌肉組織IL-1β高表達(dá)[1]。研究表明，IL-1β可通過刺激巨噬細(xì)胞過度釋放細(xì)胞因子參與缺血對骨骼肌的損傷[10]。此外，IL-1β可激活泛素-蛋白酶體通路導(dǎo)致缺血狀態(tài)下骨骼肌蛋白降解[11]。本研究表明，富氫鹽水顯著降低壓瘡深層股薄肌IL-1β含量。Okamoto等[12]在腸梗阻大鼠模型中也發(fā)現(xiàn)，連續(xù)腹腔注射富氫鹽水10 d顯著降低腸壁肌層IL-1β表達(dá)水平。以上提示，富氫鹽水可有效抑制壓瘡深部組織炎性反應(yīng)。

氧化應(yīng)激與IL-1β產(chǎn)生密切相關(guān)，目前被證明的有兩條通路：一是ROS激活轉(zhuǎn)錄因子NFκB，后者結(jié)合IL-1β啟動子，促進(jìn)其表達(dá)；二是ROS激活NLRP3炎性反應(yīng)小體中識別蛋白NOD樣受體，使之聚集形成NLRP3寡聚體，通過銜接蛋白ASC募集并激活效應(yīng)蛋白caspase-1，后者活化后切割白介素1-β(IL-1β)，使之形成成熟炎性反應(yīng)因子[13]。本研究表明，富氫鹽水顯著抑制了壓瘡深部骨骼肌NLRP3炎性小體活化，表現(xiàn)為NLRP3和ASC蛋白表達(dá)降低，同時(shí)caspase-1活性下降。研究表明，NLRP3炎性小體抑制劑INF4E明顯抑制缺血再灌注導(dǎo)致的心肌線粒體損傷，部分恢復(fù)心臟收縮功能[14]。Ystgaard等[15]報(bào)道，與野生型鼠比較，NLRP3敲除鼠海馬組織對缺血的抵抗力更強(qiáng)。以上提示，抑制NLRP3炎性反應(yīng)小體活性是富氫鹽水改善壓瘡的靶向之一。

總之，富氫鹽水可能通過抑制氧化應(yīng)激下調(diào)NLRP3炎性反應(yīng)小體活化水平，進(jìn)而抑制壓瘡誘導(dǎo)深部骨骼肌的炎性反應(yīng)，是一種潛在的改善壓瘡的治療方式。