Notch家族成員遺傳學變異預示乳頭狀 甲狀腺癌高復發(fā)風險

強 薇，袁 佳,2，陳 譜，施秉銀

(1. 西安交通大學第一附屬醫(yī)院內分泌科，陜西西安 710061；2. 民航西安醫(yī)院，陜西西安 710082)

作為最常見的內分泌系統(tǒng)腫瘤，甲狀腺癌近年來全球發(fā)病率迅速升高[1]，不僅加重醫(yī)保負擔，而且危害人民生命健康。其發(fā)病率女性高于男性，2012年全球女性約有229 900例新發(fā)病例[2]，在我國，甲狀腺癌已躍居為30歲以下女性發(fā)病率最高的腫瘤[3]。甲狀腺癌中以乳頭狀甲狀腺癌(papillary thyroid carcinoma, PTC)最為常見，占75%～80%[4]。盡管絕大多數(shù)PTC患者預后較好，仍有部分患者因腫瘤復發(fā)導致不良結局。因此，篩查具有潛在復發(fā)風險的PTC可使診治更加有的放矢，達到醫(yī)療資源優(yōu)化配置，意義重大。

Notch信號通路參與造血、心臟發(fā)育等重要進程[5-7]，其活性異常與腫瘤、自身免疫性疾病、先天性疾病等密切相關[8-10]。研究發(fā)現(xiàn)，Notch信號通路在不同組織類型的腫瘤甚至同一腫瘤的不同階段功能迥異。其在乳腺癌、胃癌、結腸癌等腫瘤中具有促癌作用[11]，而在肝癌、前列腺癌等腫瘤中具有抑癌作用[12]。與上述腫瘤中單向表達趨勢不同，在宮頸癌中隨腫瘤進展NOTCH1表達水平先降后升，提示其可能在早期具有抑癌作用，晚期則促進腫瘤進展[13]。

本研究對The Cancer Genome Atlas(TCGA)數(shù)據(jù)庫中508位PTC患者的芯片數(shù)據(jù)結合臨床資料進行分析，明確Notch家族成員NOTCH1、NOTCH2、NOTCH3及NOTCH4在PTC中的表達情況，研究其異常與臨床病理特征及腫瘤復發(fā)的相關性。

1 材料與方法

1.1數(shù)據(jù)來源對TCGA數(shù)據(jù)庫中甲狀腺癌(THCA)數(shù)據(jù)進行分析，其中包括508位患者的516例PTC標本，以及59例正常甲狀腺組織 (http://www.cbioportal. org/study?id=thca_tcga#summary)，下載相應臨床病理及RNA Seq芯片數(shù)據(jù)。

1.3基因差異表達及信號通路富集分析差異基因功能及信號通路富集分析應用cBioPortal及KEGG進行。

2 結 果

2.1Notch信號通路在PTC中的表達對516例PTC數(shù)據(jù)分析結果顯示，PTC組織NOTCH1、NOTCH3、NOTCH4 mRNA水平相較于正常甲狀腺組織上調(9.627±0.028vs. 9.354±0.082,P=0.017；11.23±0.032vs. 10.150±0.080,P<0.001；9.964±0.039vs. 9.001±0.067,P<0.001)，而NOTCH2 mRNA水平無顯著變化(11.960±0.037vs. 11.990±0.071,P=0.777，圖1)。508位PTC患者中，95位(19%)癌組織中NOTCH1(8%)、NOTCH2(5%)、NOTCH3(6%)、NOTCH4(5%)發(fā)生遺傳學異常改變[包括基因擴增、刪失、錯義突變，以及mRNA表達z-Scores(RNA Seq V2 RSEM)、蛋白表達Z-scores(PRRA)上調或下調2.0以上，圖2A]，每位患者上述分子mRNA表達見圖2B。其中NOTCH1和NOTCH3、NOTCH1和NOTCH4、NOTCH3和NOTCH4遺傳變異有共存傾向(OR=74.131,P<0.001；OR=366.438,P<0.001；OR=34.594,P=0.011，表1)。

2.2不同TNM分期PTC中Notch分子表達情況將508例患者據(jù)不同臨床病理特征分組，比較其NOTCH1、NOTCH2、NOTCH3、NOTCH4 mRNA水平，我們發(fā)現(xiàn)不同年齡(<30、30～65、≥65歲)、性別、甲狀腺放射線暴露史及一級親屬甲狀腺癌病史的患者上述分子表達無統(tǒng)計學差異，而不同癌灶起源、瘤體大小、甲狀腺包膜浸潤及淋巴結轉移的患者上述分子表達亦未見統(tǒng)計學差異。將腫瘤根據(jù)TNM分期進行分組，比較上述分子mRNA表達水平(圖3)，NOTCH1、NOTCH3、NOTCH4呈現(xiàn)出先升后降的趨勢 (9.571±0.642、9.808±0.565、9.721±0.585、9.487±0.600，P=0.014；11.156±0.706、11.340±0.680、11.367±0.717、1.167±0.775，P=0.013；9.552±0.895、10.015±0.811、9.865±0.811、9.530±0.817，P<0.001)。而NOTCH2則呈現(xiàn)相反的趨勢，在Ⅱ期達到谷底后回升(12.012±0.808、11.652±0.883、11.961±0.856、12.117±0.761，P=0.011)。

圖1PTC及正常甲狀腺組織中Notch家族成員NOTCH1、NOTCH2、NOTCH3和NOTCH4的mRNA表達情況

Fig.1 The mRNA expressions of NOTCH1, NOTCH2, NOTCH3 and NOTCH4 in PTC and normal thyroid tissues

T：腫瘤；N：正常。

圖2Notch家族成員在PTC中的遺傳變異

Fig.2 Genetic alterations of Notch family members in PTC

A：Notch家族成員在PTC中的遺傳變異頻率及類型；B：PTC患者Notch家族成員mRNA表達熱圖。

表1NOTCH1、NOTCH2、NOTCH3和NOTCH4基因異?；コ庑苑治?/p>

Tab.1 Analysis of mutual exclusivity among NOTCH1, NOTCH2, NOTCH3 and NOTCH4 in PTC

Gene AGene BPORAssociationNOTCH1NOTCH4<0.001366.438Tendency towards co-occurrenceNOTCH1NOTCH3<0.00174.131Tendency towards co-occurrenceNOTCH3NOTCH40.01134.594Tendency towards co-occurrenceNOTCH2NOTCH40.295<0.001Tendency towards mutual exclusivityNOTCH1NOTCH20.4444.519Tendency towards mutual exclusivityNOTCH2NOTCH30.5872.317Tendency towards mutual exclusivity

圖3Notch家族成員在不同TNM分期PTC中的mRNA表達

Fig.3 The mRNA expressions of NOTCH1, NOTCH2, NOTCH3 and NOTCH4 in PTC of different TNM stages

2.3Notch基因異常與甲狀腺癌患者無病生存期比較根據(jù)是否存在Notch信號通路遺傳學異常[包括基因擴增、刪失、錯義突變，以及mRNA表達z-Scores(RNA Seq V2 RSEM)上調或下調2.0以上]分組，分別對508例PTC患者繪制K-M曲線(圖4)。經(jīng)Log-rank檢驗發(fā)現(xiàn)，存在上述Notch遺傳學異常的患者，其無病生存期顯著短于未攜帶上述異常的患者(P=0.030)。

圖4PTC患者無病生存期K-M曲線

Fig.4 K-M curve of disease-free survival between groups with and without Notch alterations. Red line represents cases with and blue line represents cases without alterations

紅色：攜帶Notch成員遺傳學變異(包括基因擴增、刪失、錯義突變，以及mRNA表達z-Scores改變± 2.0以上)的患者；藍色：未攜帶上述異常的患者。

2.4Notch異常參與PTC進展的可能機制根據(jù)是否存在Notch家族成員遺傳學異常(包括基因擴增、刪失、錯義突變，以及mRNA表達z-Scores改變±2.0以上)將PTC分組，對差異表達基因并行功能及信號通路聚類分析(表2)，結果顯示Notch成員異常與細胞代謝關系最為密切，而與包括PI3K/Akt及MAPK信號通路在內的多條腫瘤信號通路均存在交互作用(表中所示為列于前40位的功能或信號通路，其中部分因與腫瘤無關被刪除)。其中Notch成員異常情況下，PI3K/Akt及MAPK信號通路發(fā)生表達改變的分子如圖5、圖6所示(紅色標注部分)。

3 討 論

近年來，甲狀腺癌發(fā)病率逐年增高，加重醫(yī)療負擔，損害人類健康，針對高復發(fā)風險患者施治是醫(yī)療資源合理配置的關鍵。

本研究通過分析TCGA數(shù)據(jù)庫中PTC數(shù)據(jù)，發(fā)現(xiàn)Notch家族成員NOTCH1、NOTCH3、NOTCH4 mRNA在PTC中表達上調，與GEERS等[16]結論一致。而上述分子表達隨腫瘤TNM分期進展先升后降，可能與腫瘤微環(huán)境、Notch配體濃度等有關。先前NOTCH1被報道作為抑癌因子在未分化甲狀腺癌(anaplastic thyroid carcinoma, ATC)中表達受抑[17]，而白蘆藜醇、橙皮素等通過恢復NOTCH1活性在ATC中發(fā)揮抑癌作用[18-19]，提示在PTC經(jīng)由低分化甲狀腺癌(poorly differentiated thyroid carcinoma, PDTC)向ATC發(fā)展的進程中，NOTCH1可能發(fā)生促癌到抑癌的功能轉換。NOTCH2在PTC中表達趨勢與其他Notch成員相反，與CHU等[20]在結腸癌中的觀察結果一致，其原因還有待探索。

表2攜帶Notch成員遺傳變異的PTC差異表達基因信號通路富集分析

Tab.2 Signaling pathway enrichment analysis of differentially expressed genes in PTC in Notch members with genetic alterations

TermCountPMetabolic pathways1634.18E-13PI3K-Akt signaling pathway571.99E-08Ribosome566.63E-22Focal adhesion514.60E-13Regulation ofactin cytoskeleton487.56E-11Endocytosis481.66E-08Spliceosome421.23E-13MAPK signaling pathway413.99E-06Phagosome392.36E-10MicroRNAs in cancer370.001233Protein processing in endoplasmic reticulum358.89E-08RNA transport351.87E-07Rap1 signaling pathway351.09E-05Ras signaling pathway349.59E-05Ubiquitin mediated proteolysis311.24E-07Insulin signaling pathway311.63E-07Cell adhesion molecules (CAMs)314.14E-07Antigen processing and presentation306.02E-12mTOR signaling pathway302.94E-06Axon guidance302.86E-05TermCountPProteoglycans in cancer280.00127Cell cycle271.48E-06Purine metabolism270.000321Chemokine signaling pathway270.000738Proteasome267.95E-14Sphingolipid signaling pathway262.84E-06Phospholipase D signaling pathway264.08E-05Thyroid hormone signaling pathway255.41E-06FoxO signaling pathway253.55E-05cGMP-PKG signaling pathway250.000718cAMP signaling pathway250.005895Lysosome242.69E-05Wnt signaling pathway240.000211Choline metabolism in cancer234.56E-06Natural killer cell mediatedcytotoxicity230.000234Transcriptionalmisregulation in cancer230.006717Fc gamma R-mediated phagocytosis224.32E-06Tight junction220.000762Hippo signaling pathway220.00244

圖5PTC中Notch成員異常與PI3K/Akt信號通路的交互作用

Fig.5 PI3K/Akt signaling pathway in PTC with Notch alteration altered genes are labeled red

紅色為差異表達的因子。

圖6PTC中Notch成員異常對MAPK信號通路的交互作用

Fig.6 MAPK signaling pathway in PTC with Notch alteration altered genes are labeled red

紅色為差異表達的因子。

而本研究結果顯示，存在Notch遺傳學異常的PTC患者無病生存期較短，可作為復發(fā)預測指標。研究發(fā)現(xiàn)，Notch信號通路對腫瘤干細胞、間質細胞及免疫細胞等進行調控[8]。其最終效應不僅取決于腫瘤類型，還受到旁系同源分子、配體、其它信號通路及腫瘤微環(huán)境影響[21]。本研究發(fā)現(xiàn)，Notch家族成員遺傳學異常與細胞代謝密切相關，并與甲狀腺癌發(fā)生、進展核心信號通路PI3K/Akt及MAPK信號通路異常共存。既往研究提出，Notch信號通路通過PI3K/Akt及MAPK通路促進腫瘤細胞生長[8]，也受其反向調控[22]。三者在PTC中的交互作用有望為靶向治療提供方向。

遺憾的是由于數(shù)據(jù)有限，本研究未能對PDTC及ATC中Notch家族成員異常進行分析，從而對其在甲狀腺癌發(fā)生、進展中的角色進行更全面的解讀。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)Notch家族成員NOTCH1、NOTCH3、NOTCH4在PTC中表達增高。Notch家族成員遺傳學變異可作為PTC患者復發(fā)風險預測因子。Notch家族成員遺傳學異常與PTC細胞代謝密切相關，并同PI3K/Akt及MAPK等腫瘤相關信號通路交互作用，為靶向藥物研發(fā)提供方向。