紫草油對肛瘺術(shù)后組織修復(fù)中Smad3表達(dá)的影響

趙誠 王未娟 張瓊

作者單位：福建中醫(yī)藥大學(xué)附屬人民醫(yī)院肛腸科，福建 福州 350004

紫草油在我院多年應(yīng)用于肛腸病術(shù)后的治療，在創(chuàng)面愈合方面效果明顯，但作用機(jī)制不明。Smad蛋白家族是細(xì)胞內(nèi)重要的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白，參與包括細(xì)胞增殖、凋亡、遷移、分化等功能。本研究以Smad3因子作為研究對象，從分子生物水平初步闡明Smad3因子表達(dá)變化與創(chuàng)面愈合過程中的關(guān)系。

1 資料與方法

1.1 診斷標(biāo)準(zhǔn)

按照《肛瘺臨床診治指南（2006版）》[1]制定的標(biāo)準(zhǔn)選取低位單純性肛瘺作為研究對象。

1.2 病例資料

本研究課題入選的150例肛瘺患者均為福建中醫(yī)藥大學(xué)附屬人民醫(yī)院肛腸二科2017年3月—2018年3月住院患者。利用簡單隨機(jī)方法將患者分成紫草油組、凡士林組、膚痔清組三組，每組各50例。

1.3 治療方法及實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 肛瘺切開術(shù) 所有病例均在局麻下行“肛瘺切開術(shù)”，各組手術(shù)當(dāng)天靜滴止血藥，手術(shù)當(dāng)天及術(shù)后第1 d、第2 d靜滴抗生素抗感染。各組患者每日便后溫水坐浴，分別予紫草油、凡士林組、膚痔清外用，均勻涂在創(chuàng)面上，厚約1 mm。分別于術(shù)后第7、14天留取血清，并記錄各組創(chuàng)面愈合時(shí)間。

1.3.2 血清提取 各實(shí)驗(yàn)組于手術(shù)后第7、14天后抽取外周靜脈血3～5 ml，離心后利用微量移液器吸取分離上層血清至1.5 ml EP管，置-70℃凍存待測。

1.3.3 RT-PCR法 用RNA提取試劑提取樣本中總RNA?？俁NA濃度和純度用使用Nanodrop2000超微量分光光度計(jì)測定，之后RT-PCR進(jìn)行按兩步法。目的基因引物∶ Smad3基因的上游引物序列為5’-GAAATCAGTTCTGGGCTATA-3’，下游引物序列為5’-CTCCAGTATTTGTCCTCTAC-3’（擴(kuò)增產(chǎn)物長度：100 bP）。內(nèi)參β-actin序列為：上游5’-ACTCTGTGTGGATTGGTGGC-3’，下游為5’-GAAAGGGTGTAAAACGCAGC-3’（擴(kuò)增產(chǎn)物長度：155 bP）。PCR反應(yīng)條件為：擴(kuò)增程序?yàn)椋?5°30 s，（95℃ 5 s，60℃ 34 s）×40個(gè)循環(huán)。各樣品的目的基因和內(nèi)參基因分別進(jìn)行Real-Time-PCR反應(yīng)。PCR產(chǎn)物在1%瓊脂糖凝膠電泳，檢測PCR產(chǎn)物是否為單一特異性擴(kuò)增條帶。

1.3.4 Western-blot法 用細(xì)胞裂解液提取總蛋白，考馬斯亮藍(lán)法測定各細(xì)胞樣本蛋白含量，取等量總蛋白用10%SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳分離，然后進(jìn)行轉(zhuǎn)膜。將封閉后的膜直接放入一抗工作液中，4℃反應(yīng)過夜。緊接著放入二抗工作液中作用60分鐘。最后曝光及洗片，用image J軟件分析灰度值。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

用SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析處理，計(jì)量資料采用（）表示，兩樣本之間采用t檢驗(yàn)，分析多樣本比較采用單因素方差分析。P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 紫草油治療肛瘺術(shù)后Smad3 mRNA表達(dá)情況

研究結(jié)果如表1顯示，經(jīng)治療，術(shù)后第14 d紫草油組中的Smad3 mRNA表達(dá)低于凡士林組、膚痔清膏組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；說明紫草油能提高降低Smad3 mRNA表達(dá)水平，進(jìn)而促進(jìn)創(chuàng)面生長，縮短愈合時(shí)間。

2.2 紫草油治療肛瘺術(shù)后Smad3蛋白表達(dá)情況

Western blotting分析結(jié)果顯示，凡士林組、膚痔清組、紫草油組治療肛瘺術(shù)后Smad3蛋白表達(dá)逐漸下降。術(shù)后第14 d紫草油組Smad3蛋白的表達(dá)水平低于其他兩組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。提示中藥紫草油能有效下調(diào)血清Smad3含量，進(jìn)而促進(jìn)創(chuàng)面愈合。詳見圖1、表2。

3 討論

肛瘺是指肛管或直腸因病理原因與肛周相通的一種異常管道，亦稱為肛管直腸瘺[2]?！段迨》健酚涊d了“巢塞直者，殺狗，取其脬，以穿螽，入直中，炊之，引出，徐以刀去其巢”，這里的“巢者”就是指現(xiàn)代的“肛門瘺管”，肛瘺牽拉切開術(shù)由此發(fā)展而來[3]。現(xiàn)代醫(yī)學(xué)提倡精準(zhǔn)治療，肛瘺的治療出現(xiàn)了損傷更小的隧道式手術(shù)方式。但由于病變部位的特殊性，一般創(chuàng)面較大且結(jié)構(gòu)較復(fù)雜。加之術(shù)后患者排便、換藥的痛苦大，恢復(fù)時(shí)間長[4]。此外傳統(tǒng)改良術(shù)式有治愈率高的優(yōu)點(diǎn)，但一直存在術(shù)后疼痛明顯、愈合時(shí)間長的問題。近年來各類生物材質(zhì)逐步應(yīng)用于肛瘺的治療術(shù)式中[5]，極大地保護(hù)了肛門括約肌的功能?，F(xiàn)代生物學(xué)技術(shù)克服了傳統(tǒng)改良術(shù)式的缺點(diǎn)，但治愈率不高，且價(jià)格昂貴，所以針對肛瘺的治療，在治愈率、術(shù)后疼痛、經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)三者之間找到平衡點(diǎn)也是肛腸科需探討努力解決的問題。

表1 三組患者術(shù)后第7、14 d Smad3 mRNA表達(dá)情況 （）

注：三組第14 d比較，*P＜0.05

組別 例數(shù) 時(shí)間 Smad3（ng/L）紫草油組 50 第7 d 0.603±0.015第 14 d 0.438±0.043*膚痔清組 50 第7 d 0.821±0.019第 14 d 0.704±0.014*凡士林組 50 第7 d 1.008±0.015第 14 d 1.036±0.036

表2 三組患者術(shù)后第7、14 d Smad3蛋白相對表達(dá)情況 （）

表2 三組患者術(shù)后第7、14 d Smad3蛋白相對表達(dá)情況 （）

注：3組第14天比較，*P＜0.05

組別 例數(shù) 時(shí)間 Smad3（ng/L）紫草油組 50 第7 d 0.312±0.021第 14 d 0.253±0.047膚痔清組 50 第7 d 0.522±0.046第 14 d 0.508±0.044*凡士林組 50 第7 d 0.754±0.021第 14 d 0.771±0.036

中醫(yī)藥在肛瘺術(shù)后創(chuàng)面修復(fù)方面有著豐富的臨床實(shí)踐經(jīng)驗(yàn)和良好的療效[6]。紫草油組方中紫草為君藥，黃連為佐藥。紫草為紫草科植物紫的根。味苦、甘，性寒。入心、肝經(jīng)。主要功效：活血、涼血、透疹解毒。多用于皮膚潰后，或用于各類慢性潰瘍，可收清熱消腫、減少滲出，從而可生肌長肉，促進(jìn)潰瘍愈合，特別是創(chuàng)面赤腫及滲出較多者。黃連性寒，味苦，有清熱、燥濕、瀉火解毒的功效。二味共為君藥共奏清熱利濕、消腫止痛之功。運(yùn)用清熱利濕化瘀法于肛瘺術(shù)后，體現(xiàn)中醫(yī)外治的優(yōu)勢在臨床的應(yīng)用。

傷口創(chuàng)面的修復(fù)過程包括四個(gè)步驟：即傷口周圍炎癥反應(yīng)、血管再生及肉芽組織的生長、結(jié)締組織和上皮細(xì)胞的修復(fù)、組織重構(gòu)以致傷口愈合[7]。Smad作為細(xì)胞內(nèi)重要的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白，可以直接參與TGF-β超家族成員以及骨形態(tài)發(fā)生蛋白等多個(gè)成員的信號傳導(dǎo)。Smad蛋白根據(jù)功能不同分為受體激活性Smads、共同介導(dǎo)性Smads及抑制性Smads。真正反映TGF-β1/Smad3信號傳導(dǎo)通路的激活水平的是活化的smad3表達(dá)水平[8-9]。Smad3蛋白能與Smad4形成復(fù)合物，促進(jìn)創(chuàng)面修復(fù)相關(guān)靶基因的表達(dá)[10]。研究表明激活 TGF-β1/Smad3信號通路，增加膠原蛋白的合成，可加速創(chuàng)面的修復(fù)[11]。因此Smad3及其產(chǎn)物可以調(diào)節(jié)創(chuàng)面愈合。過表達(dá)Smad3的成纖維細(xì)胞合成膠原能力增加，而敲除Smad3后，創(chuàng)傷愈合加速[12]。本實(shí)驗(yàn)研究中表明：3組藥物干預(yù)后Smad3表達(dá)逐漸下降。術(shù)后第14天紫草油組中的Smad3 mRNA及蛋白表達(dá)低于凡士林組、膚痔清膏組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。說明紫草油能夠干預(yù)Smad3因子的表達(dá)水平，有效促進(jìn)創(chuàng)面的愈合。

本實(shí)驗(yàn)研究說明紫草油能促進(jìn)肛瘺術(shù)后創(chuàng)面的愈合及縮短愈合時(shí)間，可能通過調(diào)節(jié)Smad3 因子表達(dá)水平。因此如何有針對性的、科學(xué)的調(diào)控Smad3因子表達(dá)，也是進(jìn)一步研究難點(diǎn)。