不同收獲期白刺花種子活力及干熱脅迫對(duì)幼苗生長發(fā)育的影響

吳麗芳， 魏曉梅， 陸偉東， 李 通， 姚晴晴， 趙小麗

(1.曲靖師范學(xué)院生物資源與食品工程學(xué)院，云南曲靖 655011；2.云南省高校云貴高原動(dòng)植物多樣性及生態(tài)適應(yīng)性進(jìn)化重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，云南曲靖 655011)

白刺花(Sophoradavidii)為豆科(Leguminosae)槐屬(Sophora)多年生落葉灌木，在我國主要分布于西北、華北、華東和西南地區(qū)，在云南昆明、玉溪、曲靖、紅河、楚雄、大理、麗江、迪慶等州(市)海拔850～2 500 m的地區(qū)廣泛分布。因其具有耐旱、耐貧瘠、根系強(qiáng)大、固氮能力強(qiáng)等特性，在喀斯特地區(qū)成為了水土保持的先鋒樹種。白刺花種皮具蠟質(zhì)，內(nèi)含膠質(zhì)，不透水、不透氣，硬實(shí)率高達(dá)81.9%[1]，若不經(jīng)特殊處理，種子萌發(fā)率極低，不能正確指示實(shí)際發(fā)芽能力。徐本美等研究得出白刺花硬實(shí)種子活力高于非硬實(shí)種子，因此認(rèn)為硬實(shí)是種子高活力的一種表現(xiàn)[2]。種子活力是決定種子或種子批在發(fā)芽和出苗期間的活性水平和行為的綜合體現(xiàn)[3]，表現(xiàn)在發(fā)芽率、成活率、耐藏性、抗老化等方面[4]，其高低主要受遺傳因素和環(huán)境條件的影響[5]。國內(nèi)外學(xué)者在農(nóng)作物如水稻[6]、大豆[7]、玉米[8]、小麥[9]上關(guān)于種子活力的研究多有報(bào)道，而有關(guān)白刺花種子活力方面國內(nèi)除了徐本美等[2]早期研究過以外，目前尚見相關(guān)報(bào)道。本研究采用連續(xù)6年收集的白刺花種子，利用氯化三苯四氮唑(TTC)法研究白刺花種子活力，為豐富白刺花種子的特性提供理論基礎(chǔ)。

高溫干旱嚴(yán)重制約植物的生長發(fā)育，我國目前約有1/3的土地面積位于干旱、半干旱地區(qū)[10]。云南干旱現(xiàn)象幾乎年年出現(xiàn)，只是出現(xiàn)的時(shí)段和影響程度不同。1997年至2006年對(duì)云南氣候研究認(rèn)為，云南高溫干旱多出現(xiàn)于4—8月之間，如2005年5月云南省元陽縣極端氣溫高達(dá)43.2 ℃，打破了1969年巧家縣的42.7 ℃極端最高氣溫的歷史紀(jì)錄[11-13]。高溫干旱協(xié)同的發(fā)生比單一的干旱或高溫對(duì)植物生長和產(chǎn)量危害要大[14]。有研究報(bào)道，高溫干旱影響了植物的葉片結(jié)構(gòu)[15]、生理變化[16]、保護(hù)酶系統(tǒng)的防護(hù)[17]、光合作用和呼吸作用[18]、蛋白質(zhì)變化等[19]。目前，對(duì)白刺花逆境的研究多側(cè)重于干旱單因子的報(bào)道，而較少研究高溫和干旱雙因子脅迫對(duì)其生長發(fā)育的影響。通過研究不同采集年份的種子活力、發(fā)芽率及干熱脅迫對(duì)幼苗生長早期形態(tài)、光合系統(tǒng)及生理生化的變化，旨在為種質(zhì)資源收集保存及干熱脅迫對(duì)幼苗的傷害提供試驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

分別于2010年10月、2011年10月、2012年10月、2013年10月、2014年10月和2015年10月，在曲靖師范學(xué)院校園里連續(xù)采集6年的白刺花種子，脫去外殼，剔除有蟲害、干癟的種子后，分選出比較大的種子保存于4 ℃低溫冰箱中備用。

1.2 不同采收期白刺花種子活力測(cè)定

采用TTC法測(cè)定種子活力[20]：分別將不同采收期的白刺花種子浸泡24 h，剝離種皮露出種胚后進(jìn)行染色，恒溫箱中保溫2 h，統(tǒng)計(jì)具有活力種子的百分率。

種子活力=有活力的種子數(shù)/測(cè)定種子總數(shù)×100%。

1.3 不同處理方法對(duì)白刺花發(fā)芽率試驗(yàn)

1.3.1 常規(guī)萌發(fā)處理 將白刺花種子用10%次氯酸鈉溶液消毒10 min，無菌水沖洗4～6次均勻放置于墊有雙層濾紙的培養(yǎng)皿中，每皿50顆，共5次重復(fù)。

1.3.2 沸水浸種 用始溫80 ℃的水浸泡種子1 d，浸泡過程中用振蕩器振蕩(70 r/min)以利于氧的吸收，然后用10%次氯酸鈉溶液消毒10 min，無菌水沖洗4～6次均勻放置于墊有雙層濾紙的培養(yǎng)皿中，每皿50顆，共5次重復(fù)。

1.3.3 濃硫酸處理 濃硫酸(比重1.84)浸泡種子30 min，處理完之后流水下沖洗3 min，再用10%次氯酸鈉溶液消毒 10 min，無菌水沖洗4～6次均勻放置于墊有雙層濾紙的培養(yǎng)皿中，每皿50顆，共5次重復(fù)。

1.3.4 劃破種皮 用解剖刀把種子劃個(gè)小口，再用10%的次氯酸鈉溶液消毒10 min，無菌水沖洗4～6次均勻放置于墊有雙層濾紙的培養(yǎng)皿中，每皿50顆，共5次重復(fù)。

1.3.5 種子培養(yǎng) 在25 ℃恒溫光照箱里暗培養(yǎng)，按照《國際種子發(fā)芽規(guī)程》第5天統(tǒng)計(jì)發(fā)芽勢(shì)，第10天統(tǒng)計(jì)發(fā)芽率。

發(fā)芽勢(shì)=5 d內(nèi)發(fā)芽種子數(shù)/供試種子數(shù)×100%；

發(fā)芽率=10 d內(nèi)發(fā)芽種子數(shù)/供試種子數(shù)×100%。

1.4 干熱脅迫下白刺花幼苗生長的生理生化的試驗(yàn)設(shè)計(jì)

1.4.1 白刺花幼苗的培育 以2014年收集的較大種子為試材，刀片劃破種皮后，70%乙醇消毒2 min，再用0.1% HgCl2溶液浸泡10 min，無菌水沖洗4～6次后接種于不填加任何激素的MS固體培養(yǎng)基(0.7%瓊脂，3%蔗糖)中，自然光照下培養(yǎng)45 d后，室溫下煉苗5 d栽植于黑色塑料花盆中(花盆介質(zhì)珍珠巖 ∶腐葉土 ∶紅壤土=1 ∶1 ∶2)，每處理栽植6盆，每盆栽種3棵，栽植好后將花盆放入實(shí)驗(yàn)室靠陽光直射的窗戶邊，當(dāng)幼苗成活后轉(zhuǎn)至校園理學(xué)樓2樓樓頂，常規(guī)澆水，生長2個(gè)月后進(jìn)行干熱脅迫處理。

1.4.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì) 干熱脅迫前5 d將植株澆足水，然后將其放入人工氣候箱進(jìn)行脅迫，脅迫期間不再澆水，脅迫溫度設(shè)定為25 ℃(T1)、30 ℃(T2)、35 ℃(T3)，25 ℃下正常澆水為對(duì)照(CK)，光照度8 000 lx，光—暗周期14 h—8 h，分別在脅迫2、5、8 d，脅迫復(fù)水后5 d測(cè)定相關(guān)指標(biāo)。

1.4.3 試驗(yàn)測(cè)定指標(biāo)及方法 葉片相對(duì)含水量：參照Chartzoulakis等的方法[21-22]，各處理分別任取5株植株上部的10張葉片，立即稱鮮質(zhì)量(mf)，然后置于水中，黑暗4 ℃條件下浸泡24 h至飽和狀態(tài)，稱量飽和鮮質(zhì)量(mt)，最后將葉片于80 ℃烘干，稱取干質(zhì)量(md)。植物葉片相對(duì)含水量(RWC)計(jì)算公式如下：

RWC=(mf-md)/(mt-md)×100%。

葉綠素含量：參照李合生的方法[20]，每一處理任取5株植株上的葉片，蒸餾水沖洗干凈，稱取0.1 g葉片研碎，用80%丙酮低溫黑暗下浸泡至完全變白，提取過濾液，用紫外分光光度計(jì)于波長646、663、470 nm下測(cè)定葉綠素a(Chla)、葉綠素b(Chlb)和類胡蘿卜素(Car)的吸光度，計(jì)算Chla、Chlb、Car的含量和Chla/Chlb以及Chl/Car的含量比值。

丙二醛(MDA)含量：采用硫代巴比妥酸比色法測(cè)定，具體過程參照上海植物生理研究所主編的《現(xiàn)代植物生理學(xué)實(shí)驗(yàn)指南》[23]。

可溶性糖含量參照李合生的蒽酮比色法[20]測(cè)定。

超氧化物歧化酶(SOD)活性：參照李合生的氮藍(lán)四唑光還原法[20]測(cè)定。

1.5 試驗(yàn)數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)

使用SPSS 13.0和Excel 2003進(jìn)行試驗(yàn)數(shù)據(jù)分析，以0.05作為差異的顯著性水平。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同采收期白刺花種子活力變化

TTC測(cè)定種子活力依據(jù)種子呼吸代謝過程中的脫氫酶與TTC反應(yīng)生成紅色的三苯甲腙(TTF)，代謝物質(zhì)越多，顏色越深，表明代謝強(qiáng)度越強(qiáng)。由圖1可以看出，2010年采收的白刺花種子活力最低，僅67.4%，2015年采收的種子活力最強(qiáng)，為76.6%，6年間種子活力下降僅9.2百分點(diǎn)。2010—2012年采收的種子活力緩慢上升，2014—2015年采收的種子活力上升較快。通過方差分析發(fā)現(xiàn)，各年間采收的種子活力沒有顯著差異。

2.2 不同采收期白刺花種子的發(fā)芽勢(shì)和發(fā)芽率

白刺花種子不透水、不透氣，種皮有蠟質(zhì)，具強(qiáng)休眠特性，須經(jīng)特殊處理才能體現(xiàn)白刺花種子的種用價(jià)值。圖2和圖3分別為白刺花的發(fā)芽勢(shì)和發(fā)芽率，發(fā)芽率的大小隨處理方法的不同差異較大。從圖3可以看出，劃破種皮能使發(fā)芽率提高至74.67%，而常規(guī)發(fā)芽方法其發(fā)芽率僅10%左右，在不同的處理中，發(fā)芽率的由高到低分別是劃破種皮>濃硫酸處理>沸水處理>常規(guī)萌發(fā)。不同年際間采收的種子，發(fā)芽率也有所差異，其中劃破種皮處理2010年采收的發(fā)芽率最高，相比而言，2015年采收的發(fā)芽率最低，這可能是由于白刺花種子在低溫儲(chǔ)藏過程中，部分有破除休眠的作用。種子發(fā)芽勢(shì)反映了種子出苗的整齊性及幼苗生長的質(zhì)量問題，通過試驗(yàn)觀察白刺花的種子發(fā)芽勢(shì)在前4 d內(nèi)均不高，且在試驗(yàn)過程中同時(shí)也觀察到，最先吸漲的種子不發(fā)芽，經(jīng)過3～4 d直至更長時(shí)間的充分吸漲后，白刺花種子才能萌發(fā)，這一現(xiàn)象表現(xiàn)出了硬實(shí)種子萌發(fā)的特性。從圖2和圖3中可以看出白刺花種子的發(fā)芽勢(shì)和萌發(fā)率受不同的萌發(fā)處理影響比較大，與種子活力無關(guān)，且不同年份采收的種子除了劃破種皮處理外，其余處理沒有明顯差異。

2.3 干熱脅迫下白刺花葉片含水量的變化

葉片相對(duì)含水量反映了植物生長過程中生化代謝強(qiáng)弱。生長旺盛時(shí)期，植物體內(nèi)的含水量高，休眠期或停止生長時(shí)，含水量低。表1所示的是高溫干旱脅迫下白刺花葉片含水量的變化。當(dāng)脅迫處理2 d時(shí)，對(duì)照處理與25 ℃干旱處理差異不顯著，30 ℃及35 ℃的高溫干旱處理與對(duì)照相比差異顯著。從植株外形看，植株長勢(shì)良好，葉片沒有太大變化，這可能也證明了白刺花具有一定高溫和干旱的忍耐力。脅迫5 d，不同高溫干旱處理下，均有顯著性差異，與對(duì)照相比，葉片含水量分別下降了9.4%， 13.6%和19.1%。脅迫8 d，明顯看到葉片萎蔫，卷曲皺縮，甚至有部分葉片外周干枯，與對(duì)照相比，均具有顯著性差異，且含水量分別下降23.2%、32.3%和48.3%。幾種處理過的葉片復(fù)水后5 d含水量也具有顯著性差異，含水量與脅迫8 d相比有所升高，但與對(duì)照相比，仍未完全恢復(fù)，說明當(dāng)高溫及干旱超過限度后，植物一經(jīng)損傷恢復(fù)起來有一定困難。

表1 干熱脅迫下白刺花葉片含水量的變化

注：不同小寫字母表示在0.05水平時(shí)的差異顯著。下表同。

2.4 干熱脅迫下白刺花光合色素含量的變化

表2為干熱脅迫下白刺花葉綠素含量的變化，從表中可以看出脅迫2 d Chla、Chlb和Car的含量隨脅迫溫度的增加有上升趨勢(shì)，可能是由于短期干熱脅迫時(shí)，葉片含水量減少，而白刺花本身對(duì)干熱的適應(yīng)能力加速了光和色素的合成，從而能補(bǔ)償植物光合作用。但Chl/Car反而下降，也就是說葉綠素a和葉綠素b合成的速率沒有胡蘿卜素合成的速率快。脅迫5 d，Chla、Chlb、Car含量和Chl/Car的變化沒有規(guī)律性，Chlb之間沒有差異，Car和Chl/Car之間差異顯著，很可能是植物在適應(yīng)環(huán)境的變化中，體內(nèi)自身代謝合成與呼吸消耗的補(bǔ)償和超補(bǔ)償能力紊亂所致。在干熱脅迫8 d后與脅迫5 d處理相比，各指標(biāo)有所變化，除Chl/Car外均呈下降趨勢(shì)，Chla、Chlb之間差異顯著，Car的含量CK與T1有顯著差異，但T2和T3沒有差異，尤其高溫35 ℃時(shí)，下降速率更快，這可能是因?yàn)槌掷m(xù)的干熱情況下，白刺花整個(gè)的色素合成系統(tǒng)受損。復(fù)水處理后，白刺花光合色素恢復(fù)不一，且各含量之間多沒有顯著差異。

表2 干熱脅迫下白刺花葉綠素含量的變化

2.5 干熱脅迫下白刺花MDA含量的變化

植物遭受逆境脅迫時(shí)，MDA會(huì)與細(xì)胞內(nèi)的物質(zhì)發(fā)生反應(yīng)，造成細(xì)胞膜系統(tǒng)發(fā)生變化，因此MDA含量的變化是細(xì)胞質(zhì)膜損傷的指標(biāo)之一。從表3可以看出，隨著脅迫時(shí)間的延長和脅迫強(qiáng)度的增加，MDA的含量增加，當(dāng)脅迫2 d時(shí)，25 ℃下MDA含量增加的不多，僅增加了16%，當(dāng)脅迫5 d時(shí)，各處理間均有顯著差異，且與對(duì)照相比，MDA分別增加了79.17%、120.83%和191.67%，增幅較大；脅迫8 d時(shí)，與對(duì)照相比，MDA分別增加了150.00%、188.46%和219.23%，增幅較脅迫2 d和脅迫5 d大，說明在高溫干旱下，隨時(shí)間的延長，膜脂過氧化反應(yīng)持續(xù)加重，植物細(xì)胞質(zhì)膜受到不同程度的損害。復(fù)水過后，細(xì)胞MDA含量雖與脅迫5 d、脅迫8 d相比有所減緩，但與脅迫2 d相比仍偏高，說明白刺花對(duì)短期干熱脅迫有一定抵抗力，超過一定時(shí)間后，細(xì)胞質(zhì)膜會(huì)受到損傷。

表3 干熱脅迫下白刺花丙二醛含量的變化

2.6 干熱脅迫下白刺花可溶性糖含量的變化

可溶性糖是植物參與滲透調(diào)節(jié)維持細(xì)胞膨壓的物質(zhì)之一，是有機(jī)碳的主要儲(chǔ)存形式。從表4可以看出，干熱脅迫下，隨著脅迫時(shí)間和脅迫強(qiáng)度的遞增，可溶性糖含量也增加。在干熱脅迫2 d，各高溫處理下可溶性糖含量逐漸增加。脅迫5、8 d，可溶性糖含量明顯上升，與對(duì)照相比，處理5 d的T3和處理8 d的T3可溶性糖含量分別增長了120%和160%。

表4 干熱脅迫下白刺花可溶性糖含量的變化

2.7 干熱脅迫下白刺花SOD活性的變化

SOD是植物體內(nèi)清除活性氧自由基的保護(hù)酶之一，它可以通過與過氧化物酶(POD)、過氧化氫酶(CAT)和抗壞血酸過氧化物酶(APX)共同作用清除超氧陰離子自由基、羥自由基和過氧化氫來減少活性氧對(duì)細(xì)胞膜的傷害、減輕膜質(zhì)過氧化和穩(wěn)定膜的透性。在植物正常生長過程中，植物體細(xì)胞內(nèi)活性氧的產(chǎn)生和清除系統(tǒng)處于相對(duì)穩(wěn)定的平衡中，當(dāng)植物受到逆境的脅迫時(shí)，活性氧會(huì)大量積累，植物保護(hù)酶的防御系統(tǒng)也相應(yīng)地變化。如表5所示，隨著干旱和溫度的加劇，SOD活性呈上升趨勢(shì)，各處理間具有顯著差異，尤其當(dāng)脅迫8 d時(shí)上升速度更快，復(fù)水后SOD值又開始下降。

表5 干熱脅迫下白刺花超氧化物歧化酶活性的變化

3 結(jié)論與討論

種子活力某種程度上代表了植物種胚的生長潛力，早期人們定義種子活力為種子在發(fā)芽和出苗期間的活性強(qiáng)度及特殊的綜合表現(xiàn)，認(rèn)為高活力的種子發(fā)芽早，出苗整齊，對(duì)不良環(huán)境的適應(yīng)能力強(qiáng)，它是種子質(zhì)量好壞評(píng)價(jià)的重要指標(biāo)之一。種子活力的高低受其本身的遺傳因素、貯藏環(huán)境和發(fā)芽環(huán)境條件影響。其中就遺傳方面，發(fā)育過程中貯藏物質(zhì)的積累是種子活力形成的基礎(chǔ)，隨著種子的生長發(fā)育、成熟，體內(nèi)蛋白質(zhì)、淀粉的積累，種子活力逐漸提高。白刺花由于種皮不透水、不透氣，存在嚴(yán)重的硬實(shí)現(xiàn)象，若不經(jīng)特殊處理，種子萌發(fā)率非常低。國際種子檢驗(yàn)規(guī)程(ISTA 2005)[24]以及我國國家質(zhì)量技術(shù)監(jiān)督局發(fā)布的牧草種子國家標(biāo)準(zhǔn)(2001年)、林木種子國家標(biāo)準(zhǔn)(2000年)和農(nóng)作物國家標(biāo)準(zhǔn)(1996年)[25]將硬實(shí)納入“未萌發(fā)種子”(ungerminated seeds)范疇。此類劃分對(duì)于硬實(shí)種子而言，制約了它的發(fā)育特性。早期人們研究就得出硬實(shí)種子的高活力特性具有普遍性，硬實(shí)程度的強(qiáng)弱與種子活力的高低呈正相關(guān)[26]。本研究中，種子采收越早，活力越低，可能是白刺花種子儲(chǔ)藏過程中有破除休眠的特性，致使代謝活性變化所致。但從6年的采收間隔而言，種子活力下降僅9.2百分點(diǎn)，年份間的變化沒有顯著差異，這充分證實(shí)了硬實(shí)種子高活力的特性。

不同處理方法對(duì)白刺花種子萌發(fā)率的影響有很大的差異，濃硫酸處理主要是利用強(qiáng)酸的腐蝕性作用使種皮充分吸漲，沸水處理也是促使種子的吸漲作用。在一些報(bào)道中，白刺花的種子萌發(fā)率最高的是砂紙摩擦處理，可以使發(fā)芽率達(dá)到70%以上[27-28]。砂紙摩擦與劃破種皮一樣，都是直接破除種皮吸水障礙，2種處理方法各有優(yōu)劣，劃破種子不利于大規(guī)模的使用，砂紙摩擦容易損傷種子。規(guī)?；纳a(chǎn)中，建議采用沸水處理，簡(jiǎn)單方便。

水是生命活動(dòng)過程中不可缺少的，它參與了植物的代謝過程，一般來說植物組織含水量的多少與其生命活動(dòng)強(qiáng)弱有平行關(guān)系，在一定范圍內(nèi)組織的代謝強(qiáng)度與其含水量成正相關(guān)。本研究中隨著干熱脅迫時(shí)間的延長和脅迫溫度的增加，葉片相對(duì)含水量降低，而短時(shí)期的脅迫下，白刺花的光合色素含量反而升高，這可能是因?yàn)榘状袒ㄈ~片含水量降低致使葉片縮小或卷曲而要提高光合作用的情況下所形成的一種補(bǔ)償作用。

MDA作為植物細(xì)胞膜不飽和脂肪酸發(fā)生過氧化作用的最終產(chǎn)物，含量高低反映細(xì)胞膜受傷害的程度，本研究中隨著脅迫強(qiáng)度的增加MDA的含量也遞增，尤其當(dāng)脅迫8 d時(shí)上升最快?？扇苄蕴亲鳛閰⑴c滲透調(diào)節(jié)維持細(xì)胞膨壓的重要物質(zhì)，干熱脅迫下，植物體內(nèi)的可溶性糖會(huì)大量積累，積累量越大，抗性越強(qiáng)。有研究認(rèn)為，成熟白刺花葉片的抗氧化酶活性較高，其干旱適應(yīng)性越強(qiáng)[29]。在植物的抗氧化系統(tǒng)功能所能容許限度內(nèi)，干旱脅迫強(qiáng)度與抗氧化酶活性存在明顯的劑量效應(yīng)。本研究中隨著干熱脅迫強(qiáng)度的加大，SOD活性也逐漸遞增，說明白刺花對(duì)干熱脅迫具有較強(qiáng)的耐受能力。