慢性阻塞性肺疾病小鼠肺組織中Th17/Treg細(xì)胞的變化及意義

張婧 張?zhí)m英 歐陽瑤（通訊作者）

（遵義醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院 貴州 遵義 563000）

慢性阻塞性肺疾?。╟hronic obstructive pulmonary disease，COPD）是一種常見的可以預(yù)防和治療的呼吸系統(tǒng)疾病，其發(fā)病率和死亡率在全球范圍內(nèi)呈逐年上升趨勢(shì)[1]。COPD的發(fā)病與長(zhǎng)期吸煙等有害因素引起的異常炎癥反應(yīng)密切相關(guān)，但其具體機(jī)制至今尚不明了。最新研究表明，CD4+T淋巴細(xì)胞介導(dǎo)的免疫炎癥可能與COPD的發(fā)病有關(guān)[2,3]。輔助性T細(xì)胞 17（Thelpercells 17，Th17）和調(diào)節(jié)性T細(xì)胞（regulatory T cells，Treg）是重要的CD4+T細(xì)胞亞群。Th17細(xì)胞可以促進(jìn)炎癥反應(yīng)的發(fā)生[4]，白細(xì)胞介素-17（interleukin-17，IL-17）是它分泌的一種關(guān)鍵性活化因子，可以促使多種細(xì)胞釋放炎性介質(zhì)，從而介導(dǎo)炎癥反應(yīng)。而Treg細(xì)胞具有免疫抑制作用，不僅能抑制炎性介質(zhì)的產(chǎn)生，還能抑制炎性細(xì)胞的分化、增殖，叉頭狀轉(zhuǎn)錄因子3（forkhead box protein 3，F(xiàn)oxp3）可以控制它的生長(zhǎng)、分化和功能，是鑒定Treg最可靠的檢測(cè)指標(biāo)。在炎癥性疾病發(fā)病中兩種細(xì)胞在功能上相互拮抗。正常狀態(tài)下，Treg細(xì)胞和Th17細(xì)胞之間的相對(duì)平衡在維持免疫穩(wěn)態(tài)中有決定性意義。若這種平衡被破壞，就會(huì)導(dǎo)致免疫炎癥性疾病發(fā)病[5,6]。

因此，本研究擬通過煙熏法建立COPD小鼠模型，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)小鼠肺組織中Th17細(xì)胞和Treg細(xì)胞的變化，以期為COPD的發(fā)病機(jī)制提供新的理論依據(jù)。

1.材料

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

SPF級(jí)C57BL/6小鼠26只，雌雄不限，6～8周齡，體重20g～25g，由第三軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)中心提供，許可證號(hào)為SCXK（渝）2012-0005。

1.2 主要材料

黃果樹牌香煙（焦油量：11mg；煙氣煙堿量：0.9mg；煙氣一氧化碳量：13mg）（貴州中國(guó)工業(yè)有限責(zé)任公司）。Anti-Mouse CD4 FITC、Rat IgG2a K Isotype Control FITC、Anti-Mouse CD25 PE-Cyanine5、Rat IgG1 K Isotype control PE-Cyanine5、Anti-Mouse/Rat Foxp3 APC Rat IgG2a K Isotype control APC、Anti-Mouse/Rat IL-17A PE、Rat IgG2a K Isotype control PE、Flow Cytometry Staining buffer、Fixation/Permeabilization Concentrate Fixation/Permeabilization Diluent（上述試劑均來自eBioscience公司）。

2.方法

2.1 動(dòng)物模型的制備和分組

將26只C57BL/6小鼠隨機(jī)分為對(duì)照組（n=10）和COPD模型組（n=16）。將16只模型組小鼠置于自制有機(jī)玻璃煙熏箱內(nèi)（大小為90cm×40cm×30cm，箱蓋上有9個(gè)1.5cm×1.5cm大小的通氣孔），每日被動(dòng)吸煙4次，6支煙/次，1h/次，共28天。10只對(duì)照組小鼠則暴露于空氣中，正常飼養(yǎng)。

2.2 肺組織病理學(xué)檢測(cè)

取小鼠右肺下葉用4% 的多聚甲醛固定 24 h ，石蠟包埋切片，組織切片進(jìn)行 HE 染色。使用軟件IPWin32采集HE染色切片圖像，隨機(jī)采集多個(gè)完整氣道圖像，最后由我院病理科醫(yī)師分析圖片。

2.3 制備單細(xì)胞懸液

在RPMI 1640培養(yǎng)基中加入Ⅳ型膠原酶粉，配制Ⅳ型膠原酶。將肺組織剪碎，放入盛膠原酶的離心管中，置于水浴箱內(nèi)（37℃），直至肺組織消化，收集消化液，過濾至第二個(gè)試管，離心，棄上清；加入2ml PBS，用吸管吹打，離心，棄上清；加入5ml紅細(xì)胞裂解液，裂解直至溶液透明，離心，棄上清；再用PBS漂洗，離心，棄上清；最后加入1ml含1%FBS的PBS及200ul 1%多聚甲醛，振蕩混勻，即為所需懸液。

2.4 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)CD4+IL-17和CD4+CD25+ Foxp3的變化

CD4+IL-17檢測(cè)：在250ul單細(xì)胞懸液中加入250ul RPMI1640培養(yǎng)基，再加入2ul 250×PMA/Ionomycin及2ul 250×Monensin/BFA，置于5%CO2孵箱內(nèi)培養(yǎng)5h；測(cè)定管加入4ul Anti-Mouse CD4 FITC，對(duì)照管加入4ul Rat IgG2a K Isotype Control FITC；各加入200ul培養(yǎng)好的單細(xì)胞懸液，孵育、固定、漂洗、溶血、破膜，再于測(cè)定管中加入2ulAnti-Mouse/Rat IL-17A PE，對(duì)照管中加入2ulRat IgG2a K IsotypecontrolPE，然后孵育、漂洗，上機(jī)檢測(cè)。

CD4+CD25+Foxp3檢測(cè)：測(cè)定管加入4ul Anti-Mouse CD4 FITC、2ul Anti-Mouse CD25 PE-Cyanine 5，對(duì)照管加入4ul Rat IgG2a K Isotype Control FITC、2ul Rat IgG1 K Isotype control PE-Cyanine 5；各加入200ul單細(xì)胞懸液，孵育、漂洗，漩渦震蕩細(xì)胞沉淀，各管中加入1ml現(xiàn)配制的固定/破膜工作液，再孵育、漂洗；測(cè)定管中加入5ul Anti-Mouse Foxp3 APC，對(duì)照管中加入5ul Rat IgG2a K Isotype control APC，最后孵育、漂洗，上機(jī)檢測(cè)。

2.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

3.結(jié)果

3.1 兩組小鼠的一般情況

對(duì)照組：小鼠全身皮毛光澤，精神活動(dòng)正常自如，呼吸平穩(wěn)，食欲正常，體重增加，體型飽滿，實(shí)驗(yàn)期間小鼠無死亡。

COPD模型組：小鼠全身皮毛干枯、灰暗，精神倦怠，雙眼微閉，活動(dòng)減少，呼吸急促，食欲減退，體重下降，且上述癥狀呈逐漸加重趨勢(shì)，煙熏期間小鼠無死亡。

3.2 光鏡觀察小鼠肺組織病理特征

對(duì)照組：肺泡結(jié)構(gòu)清晰，肺泡壁完整且連續(xù)，肺泡間隔可見少量炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)（見圖1A）。

COPD模型組：肺泡結(jié)構(gòu)破壞，多數(shù)肺泡相互融合形成較大的肺泡腔，肺泡間隔有明顯的炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)（見圖1B）。

圖1 實(shí)驗(yàn)第28天兩組小鼠肺組織HE染色（×200倍）

3.3 小鼠肺組織中Th17和Treg的百分比含量

將收集的肺組織標(biāo)本予以處理后，采用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)Th17和Treg的變化，結(jié)果顯示：與對(duì)照組（0.66±0.28）相比，Th17的百分比含量在模型組小鼠肺組織中（2.41±0.33）增高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）（見表1）。模型組小鼠肺組織中Treg的百分比含量（0.37±0.11）較對(duì)照組（0.93±0.30）降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）（見表1）。

表1 兩組小鼠肺組織中Th17和Treg的百分比含量（±s）

表1 兩組小鼠肺組織中Th17和Treg的百分比含量（±s）

注：與對(duì)照組（Th17）相比，*P＜0.05；與對(duì)照組（Treg）相比，ΔP＜0.05。

組別（例數(shù)） Th17（%） Treg（%）對(duì)照組（n=10） 0.66±0.28 0.93±0.30 CODP 模型組（n=16） 2.41±0.33* 0.37±0.11Δ

3.4 小鼠肺組織中Th17/Treg的比值

模型組小鼠肺組織中Th17/Treg的比值（7.26±2.97）高于對(duì)照組（0.50±0.24），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）（見表2）。

表2 兩組小鼠肺組織中Th17/Treg的比值（±s）

表2 兩組小鼠肺組織中Th17/Treg的比值（±s）

注：與對(duì)照組相比，*P＜0.05。

組別（例數(shù)） Th17/Treg對(duì)照組（n=10） 0.50±0.24 COPD模型組（n=16） 7.26±2.97*

4.討論

COPD是一個(gè)嚴(yán)重危害公眾健康的全球性問題。吸煙被公認(rèn)為COPD發(fā)病最關(guān)鍵的誘發(fā)因素，然而，COPD患者戒煙后肺組織及氣道炎癥仍持續(xù)存在，這表明COPD的發(fā)病機(jī)制可能與自身免疫炎癥有關(guān)。香煙煙霧可能導(dǎo)致T細(xì)胞啟動(dòng)一個(gè)“異?！钡拿庖邞?yīng)答，導(dǎo)致機(jī)體免疫失調(diào)，使COPD患者易患呼吸道感染[7]。

本研究采用煙熏法建立COPD小鼠模型，煙熏第28天取小鼠肺組織行HE染色，觀察肺組織病理形態(tài)變化，結(jié)果顯示：與健康對(duì)照組相比，COPD模型組小鼠有明顯的肺部炎癥及肺氣腫改變，符合人類COPD的特征性病理變化，提示COPD小鼠模型建立成功。

迄今為止，在COPD的發(fā)病機(jī)制中香煙煙霧對(duì)初始T細(xì)胞的作用尚不明確。因此，本實(shí)驗(yàn)觀察香煙煙霧誘導(dǎo)的COPD小鼠模型肺組織中Th17細(xì)胞和Treg細(xì)胞的變化，結(jié)果表明COPD模型組小鼠肺組織中Th17的百分比含量高于對(duì)照組，而Treg的百分比含量則低于對(duì)照組。香煙煙霧是Th17細(xì)胞的一種有效佐劑，它能夠誘導(dǎo)IL-1β、IL-6等效應(yīng)性細(xì)胞因子的產(chǎn)生[8]，這一類細(xì)胞因子又能夠抑制Foxp3的表達(dá)和Treg細(xì)胞的分化，并且使Treg細(xì)胞向Th17細(xì)胞轉(zhuǎn)化，這可能是COPD中存在Th17/Treg失衡的原因之一。有研究者發(fā)現(xiàn)在慢性過敏性氣道炎癥中Th17細(xì)胞可以抑制Treg細(xì)胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答[9]。也有研究發(fā)現(xiàn)在肺炎支原體抗原誘導(dǎo)的炎癥模型中Treg細(xì)胞又可通過減少IL-17的產(chǎn)生抑制Th17細(xì)胞介導(dǎo)的免疫激活[10]。Th17/Treg 失衡與COPD患者的肺功能惡化和疾病進(jìn)展有關(guān)[11]。上述結(jié)果均提示Th17細(xì)胞和Treg細(xì)胞介導(dǎo)的免疫失衡在COPD的發(fā)病過程中可能具有重要的作用。

為了評(píng)估COPD模型組小鼠體內(nèi)Th17/Treg失衡的程度，本研究計(jì)算每一個(gè)實(shí)驗(yàn)標(biāo)本中Th17與Treg的比值，結(jié)果顯示與對(duì)照組相比，COPD模型組小鼠肺組織中Th17與Treg的比值增高，提示香煙煙霧打破Th17/Treg的相對(duì)平衡，偏向于Th17細(xì)胞介導(dǎo)的免疫炎癥反應(yīng)，同時(shí)抑制Treg細(xì)胞的免疫調(diào)節(jié)作用，從而使COPD的炎癥反應(yīng)持續(xù)存在且不斷放大，因此，有效調(diào)節(jié)Th17/Treg失衡可能是延緩COPD病情進(jìn)展的關(guān)鍵關(guān)節(jié)。

總之，本研究結(jié)果提示香煙煙霧可能導(dǎo)致Th17細(xì)胞和Treg細(xì)胞介導(dǎo)的免疫失衡，提示肺組織中Th17/Treg失衡可能參與COPD的發(fā)病機(jī)制。為了提供COPD患者更好的臨床治療方案，我們?nèi)孕柽M(jìn)一步研究如何調(diào)節(jié)其免疫失衡。