硝苯地平骨架型緩釋微丸在大鼠體內(nèi)藥代動力學(xué)及其與CYP3A4代謝酶活性的關(guān)系

張瑞卿，楊文倩，余裕炳，涂家生，孫益新*

(1南京醫(yī)科大學(xué)附屬兒童醫(yī)院，南京 210000；2中國藥科大學(xué)藥學(xué)院藥劑系，南京 210009)

高血壓是當今世界最常見的心血管疾病之一，流行病學(xué)研究顯示，目前全球有高血壓患者6億人，患病率約為10%。硝苯地平為第一代二氫吡啶類鈣拮抗劑，臨床上多用于高血壓和心絞痛等疾病的預(yù)防和治療[1]。高血壓患者一般需要長期服藥來維持其血壓的穩(wěn)定，因此高血壓類藥物適合于制備緩控釋制劑，延長體內(nèi)作用的時間，減少每日用藥次數(shù)，減少峰谷現(xiàn)象，降低不良反應(yīng)。硝苯地平半衰期t1/2呈雙相，t1/2α為2.5～3 h，t1/2β為5 h，且在大鼠各腸段均有良好吸收[2-3]，適于設(shè)計成緩控釋制劑。

硝苯地平口服后在胃腸道內(nèi)幾乎完全吸收，但是有很強的首過作用，F(xiàn)oster等[2]研究表明口服硝苯地平生物利用度只有0.45。硝苯地平在體內(nèi)被CYP3A4酶氧化成吡啶類似物，進一步形成酸性代謝物從尿液排出[4]，而多態(tài)性研究表明，CYP3A4活性具有廣泛的個體差異，并顯示出明顯的種族和疾病分布特征。硝苯地平口服后患者間的血藥濃度差異比較大，提示可能是由于患者間代謝硝苯地平的肝藥酶的水平差異所導(dǎo)致。

細胞色素P450是人體內(nèi)代謝藥物的主要酶系，其中CYP3A4參與人體50%以上的藥物代謝[5]，其活性改變可引起藥物的動力學(xué)產(chǎn)生個體差異[6-7]。硝苯地平是CYP3A4的底物，個體間酶活性的差異可能會導(dǎo)致硝苯地平藥代動力學(xué)的差異，可以通過測定CYP3A4活性尋找硝苯地平個體間藥代動力學(xué)差異的原因。CYP3A4活性常用的測定方法有紅霉素呼吸試驗[8]、咪唑安定法[9]和氫化可的松法[10]。本實驗采用氫化可的松為探針，HPLC梯度洗脫法測定人24 h尿液中氫化可的松(FC)及其代謝產(chǎn)物6β-羥基氫化可的松(6β-OHF)的含量，計算其比值6β-OHF/FC來衡量CYP3A4的表型活性，為臨床用藥提供參考依據(jù)。

本研究以大鼠為試驗對象，以市售硝苯地平片為參比制劑，研究其和自制硝苯地平骨架緩釋微丸的體內(nèi)藥代動力學(xué)，采用Kinetica程序計算相關(guān)參數(shù)，建立體內(nèi)外相關(guān)性，為自制硝苯地平緩釋微丸的質(zhì)量評價提供依據(jù)。并研究CYP3A4活性與硝苯地平緩釋微丸藥代動力學(xué)性質(zhì)的關(guān)系，為個體化用藥研究提供一種新的思路。

1 材 料

1.1 儀 器

Ultimate 3000系列高效液相色譜儀(美國戴安Dionex公司)；Agela C18色譜柱(4.6 mm×250 mm，5 μm；4.6 mm×150 mm，5 μm，美國Agela公司)；Waters高效液相色譜儀(美國Waters公司)；HW-2000色譜數(shù)據(jù)工作站(上海千普軟件有限公司)；ZH-B6 大鼠代謝籠(淮北正華儀器設(shè)備有限公司)；TGL-16B型高速離心機(上海安亭科學(xué)儀器廠)。

1.2 試 藥

FC對照品、地塞米松對照品、尼群地平對照品(純度>99%，中國藥品生物制品檢定所)；6β-OHF對照品(純度≥98%，美國Sigma-aldrich公司)；FC注射液(規(guī)格5 mL∶25 mg，天津金耀氨基酸有限公司)；硝苯地平緩釋微丸(自制[11]，批號20100201)；硝苯地平片(規(guī)格10 mg，常州康普藥業(yè)有限公司)；大鼠灌胃小膠囊(規(guī)格20 μL，潮州強基制藥有限公司)；甲醇(色譜純，山東禹王實業(yè)有限公司)；乙腈(色譜純，美國Tedia公司)；其他試劑均為分析純，水為重蒸水。

1.3 動 物

SD大鼠，體重(200±11) g，雄性，南京青龍山養(yǎng)殖場提供，合格證號SCXK(浙)2014-0001

2 方 法

2.1 大鼠體內(nèi)CYP3A4代謝酶活性的測定

2.1.1 探針給藥及尿液收集方法 取SD大鼠10只，給藥前禁食12 h，按照9 mg/kg劑量尾靜脈注射給予氫化可的松注射液，然后將大鼠置于代謝籠中24 h，收集24 h尿液，于-20 ℃冰箱中冷藏保存待測。

2.1.2 色譜條件 色譜柱：Agela C18柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)；流動相：乙腈(A相)和7.56 mmol/L硫酸銨水溶液(B相)，梯度洗脫[12](0～6.5 min，A：10%，B：90%；6.5～15 min，A：35%，B：65%，線性變化；15～24 min，A：35%，B：65%；24～28 min，A：10%，B：90%，線性變化；28～32 min，A：10%，B：90%)；柱溫40 ℃；流速1.0 mL/min；UV檢測波長：240 nm；內(nèi)標：地塞米松(DM)。

2.1.3 尿樣處理方法 取4 000 r/min離心后的大鼠尿樣2 mL加入試管中，隨后加入100 μg/mL內(nèi)標溶液20 μL和1 mol/L NaOH溶液100 μL，振蕩混合30 s后加入乙酸乙酯-乙醚(4∶1)混合提取劑5 mL，室溫下振蕩提取5 min，4 000 r/min離心10 min，去水相，有機相中加入含有飽和Na2SO4的1 mol/L NaOH溶液2 mL洗滌，振蕩后4 000 r/min離心10 min，去水相，有機相中加入含有飽和Na2SO4的1%醋酸溶液2 mL洗滌后，取有機相3 mL在50 ℃水浴中氮氣吹干，殘渣用甲醇200 μL溶解，振蕩混勻，10 000 r/min離心3 min后，取上清液20 μL進樣。

2.1.4 標準曲線 精密稱取FC和6β-OHF對照品，用甲醇溶解并稀釋成儲備液(100 μg/mL)。配制FC和6β-OHF質(zhì)量濃度分別為 0.01，0.02，0.05，0.1，0.15，0.3，0.5，1，2 μg/mL的對照品溶液2 mL，按“2.1.3”項尿樣處理方法提取并測定。

2.1.5 精密度 分別配制高、中、低質(zhì)量濃度的FC和6β-OHF對照品水溶液(0.02、0.1、0.5 μg/mL)，按“2.1.3”項下提取，進行日內(nèi)精密度和3 d日間精密度的測定。

2.1.6 回收率 在含有已知濃度的FC和6β-OHF(0.02、0.1、0.5 μg/mL)水溶液2 mL中加入100 μg/mL內(nèi)標溶液20 μL，每個濃度平行制備3份，按“2.1.3”項下提取測定，方法回收率為所得濃度和投入量之比，提取回收率為待測物提取前后峰面積比。

2.2 大鼠體內(nèi)藥代動力學(xué)研究

2.2.1 給藥方案 取“2.1.1”中已測得CYP3A4活性4 d后的SD大鼠10只，隨機分為2組，分別經(jīng)口給予受試制劑與參比制劑。給藥劑量為2.7 mg/kg，服藥前禁食12 h，空腹給藥，用特制小膠囊灌胃，同時灌服生理鹽水。

2.2.2 樣品采集 受試制劑組：給藥后于0.5、1、2、3、4、6、8、10、12、16、24和36 h眼靜脈取血0.5 mL；參比制劑組：給藥后于0.33、0.66、1、1.5、2、2.5、3、4、6、8、12和16 h眼靜脈取血0.5 mL；血樣置于涂有肝素的塑料離心管中，10 000 r/min離心3 min，分離血漿樣品于-20 ℃冰箱中保存待測。

2.2.3 色譜條件 色譜柱：Agela C18柱(4.6 mm×150 mm，5 μm)；流動相：甲醇-水(60∶40)；檢測波長：350 nm(0.3 AUFS)；流速：1 mL/min；柱溫：35 ℃。內(nèi)標物：尼群地平(NT)。

2.2.4 血漿樣品的處理和測定[13-15]取大鼠空白血漿150 μL于具塞玻璃離心管中，加入5 μg/mL尼群地平(內(nèi)標)15 μL及氨水20 μL，渦旋混合30 s，加入乙醚3 mL，渦旋混合3 min，4 000 r/min離心5 min，取上層有機相2.6 mL于離心管中，40 ℃水浴下氮氣吹干。殘渣用流動相150 μL渦旋溶解，高速離心5 min，取上清液50 μL進樣。

2.2.5 專屬性 分別取大鼠空白血漿、加入一定濃度的硝苯地平和內(nèi)標溶液的空白血漿以及給藥4 h后收集的血漿樣品150 μL，按“2.2.4”項下操作，記錄色譜圖。

2.2.6 檢測限和定量限 制備硝苯地平質(zhì)量濃度分別為2、4、10 ng/mL的溶液，50 μL進樣，以峰高接近基線噪音3倍時的濃度為檢測限；以峰高接近基線噪音10倍時的濃度為定量限。

2.2.7 標準曲線 精密稱取干燥至恒重的硝苯地平對照品10 mg，用甲醇溶解并稀釋儲備液(100 μg/mL)。取大鼠空白血漿135 μL，精密加入不同濃度的硝苯地平儲備液 15 μL，配制硝苯地平質(zhì)量濃度為0.02,0.05,0.1,0.15,0.3,0.5,0.75,1 μg/mL的樣品，按“2.2.4”項下處理并測定。

2.2.8 回收率及精密度 按“2.2.7”項下配制硝苯地平質(zhì)量濃度為20，100，500 ng/mL的血漿樣品。按“2.2.4”項下處理測定，方法回收率為所得濃度和投入量之比，提取回收率為待測物提取前后峰面積比。另取上述溶液，同法操作，進行日內(nèi)精密度和3 d日間精密度的測定。

3 結(jié) 果

3.1 大鼠體內(nèi)CYP3A4代謝酶活性的測定

3.1.1 色譜行為 在本實驗建立的色譜分離條件下，F(xiàn)C、6β-OHF和內(nèi)標地塞米松的保留時間分別為13.75，20.50和24.65 min(圖1)，尿樣中的雜質(zhì)不影響FC和6β-OHF的分離。

3.1.2 標準曲線 以峰面積比值對濃度進行線性回歸，得到標準曲線方程FC：Y=0.557 1X+0.001 8，r=0.999 4；6β-OHF：Y=1.231 5X+0.012 3，r=0.999 9。結(jié)果表明FC在0.01～2 μg/mL，6β-OHF在0.01～1 μg/mL質(zhì)量濃度范圍內(nèi)峰面積比與質(zhì)量濃度呈良好的線性關(guān)系。

Figure1 HPLC chromatograms of standard solution (A) and urine sample (B)

1：6β-Hydroxycortisol;2：Hydrocortisone;3：Internal standard (dexamethasone)

3.1.3 精密度 6β-OHF低、中、高濃度的日內(nèi)精密度RSD(%)分別為3.94、2.09、2.06，日間精密度RSD(%)分別為4.88、2.71、1.98。FC低、中、高濃度的日內(nèi)精密度RSD(%)分別為2.75、3.02、2.23，日間精密度RSD(%)分別為4.29、3.01、1.82。日內(nèi)日間精密度均小于10%。

3.1.4 方法回收率 6β-OHF低、中、高濃度的方法回收率(%)分別為101.93、97.90、98.53，RSD(%)分別為4.59、4.91、3.78；FC低、中、高濃度的方法回收率(%)分別為103.80、97.82、100.68，RSD(%)分別為3.39、4.50、4.64。

3.1.5 提取回收率 6β-OHF低、中、高濃度的提取回收率(%)分別為84.26、84.43、90.34，RSD(%)分別為4.54、5.38、2.60；FC低、中、高濃度的提取回收率(%)分別為89.98、85.74、86.77，RSD(%)分別為6.23、4.71、2.61。地塞米松的提取回收率為84.26%，RSD為4.54%。6β-OHF、FC和地塞米松的平均提取回收率都在75%以上，提取回收率穩(wěn)定。

3.1.6 大鼠CYP3A4活性測定結(jié)果 測定FC和6β-OHF的含量，CYP3A4活性表示為[6β-OHF]/[FC]，在本研究中，CYP3A4活性只是一個比值，并無單位。FC平均濃度為(8.477±3.504) μg/mL，6β-OHF平均濃度為(2.321±1.693) μg/mL，[6β-OHF]/[FC]均值為0.271±0.129。結(jié)果表明，F(xiàn)C和6β-OHF的濃度變化范圍較大，但其比值變化范圍相對較小，可作為CYP3A4活性的參考。

3.2 大鼠體內(nèi)藥代動力學(xué)

3.2.1 專屬性 在本實驗建立的色譜分離條件下，硝苯地平與內(nèi)標尼群地平均有較大的色譜峰，峰形良好，且理論塔板數(shù)都大于2 000，兩者的保留時間分別為6.252和12.214 min(圖2)，血漿中雜質(zhì)對測定無干擾。

Figure2 Chromatograms of blank plasma(A),plasma sample with nifedipine and internal standard (B),and rat plasma 4 hours after oral administration of nifedipine sustained release pellets (2.7 mg/kg)(C).1:Nifedipine;2:Internal standard (nitrendipine)

3.2.2 標準曲線、檢測限與定量限 以血漿中硝苯地平濃度與硝苯地平對尼群地平的峰面積之比NF/NT進行加權(quán)回歸，得到回歸方程NF/NT=0.001 7c+0.003 3，r=0.999 3。在20～1 000 ng/mL質(zhì)量濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。LOD以S/N=3計為4 ng/mL，LOQ以S/N=10計為10 ng/mL。

3.2.3 回收率和精密度 低、中、高濃度的方法回收率(%)分別為93.82、94.79、98.08，RSD(%)分別為5.13、3.58、2.33。提取回收率(%)分別為81.79、80.59、84.93，RSD(%)分別為5.00、4.64、2.20。平均提取回收率大于75%，提取回收率穩(wěn)定。

日內(nèi)精密度 RSD(%)分別為4.28、3.48、3.05，日間精密度RSD(%)分別為9.18、4.54、4.04。日內(nèi)日間精密度RSD均小于10%，分析良好。

3.2.4 藥物動力學(xué)試驗結(jié)果 經(jīng)HPLC測定后，繪制出兩組數(shù)據(jù)的血藥濃度-時間曲線(圖3)。

3.2.5 房室模型擬合 采用Kinetica 4.4.1實用藥代動力學(xué)程序?qū)κ惺壑苿┖途忈屛⑼杷巹訑?shù)據(jù)進行隔室模型的擬合，比較赤池信息判據(jù)(Akaike′s information criterion,AIC)，經(jīng)最小AIC判別法確定，結(jié)果表明兩組制劑均符合開放二室模型，其藥代動力學(xué)參數(shù)如表3所示。

3.2.6 非隔室模型統(tǒng)計結(jié)果 采用統(tǒng)計矩的原理對體內(nèi)血濃藥時曲線進行非模型化解析。由表4可知自制硝苯地平緩釋制劑和市售普通片相比平均MRT增加、平均tmax增加、平均cmax減少，結(jié)果表明，自制硝苯地平制劑在大鼠體內(nèi)有一定的緩釋效果。

Table3 Pharmacokinetic parameters of nifedipine sustained-release pellet and immediate-release tablet using model compartments

ParameterImmediate-release tabletSustained-release pelletKa /h-10.6190.213tmax /h1.7996.028cmax /(μg/mL)643.353191.473t1/2α /h1.2775.863t1/2β/h5.5244.290AUC0-∞/(ng/L·h)3 585.9963 274.257t1/2Ka/h1.1213.255MRT/h4.92712.775

ParameterImmediate-release tabletSustained-release pellett1/2/h2.418±0.4568.271±0.837*tmax /h1.500±0.5188.000±1.789*cmax /(ng/mL)680.907±218.610200.915±109.733*AUC0-∞/(ng/L·h)3 527.961±643.6423 387.524±709.229MRT /h4.248±0.54713.890±1.635*

*P<0.005 vs immediate-release tablet group

3.2.7 6β-OHF/FC與硝苯地平緩釋微丸藥物動力學(xué)的關(guān)系 將緩釋微丸組(1～5號大鼠)和市售組(6～10號大鼠)的藥代動力學(xué)相關(guān)參數(shù)CL、AUC和cmax分別對6β-OHF/FC進行線性回歸。由表5可知在自制硝苯地平緩釋制劑組中，CL和AUC對6β-OHF/FC顯著相關(guān)，而cmax對6β-OHF/FC的相關(guān)性次之。在市售普通片組中，AUC對6β-OHF/FC顯著相關(guān)，CL次之，而cmax對6β-OHF/FC 的相關(guān)性較弱。

Table5 Correlation coefficient of 6β-OHF/FC and pharmacokinetic parameters of nifedipine matrix sustained-release pellets and immediate-release tablets

GroupParameterCLAUCcmaxNifedipine matrix sustained-release pelletsr0.953 2-0.953 5-0.819 7P0.011(<0.05)0.032(<0.05)0.184Nifedipine immediate-release tabletsr0.832 4-0.843 4-0.721 9P0.0760.034(<0.05)0.150

4 討 論

本研究以地塞米松為內(nèi)標，同時測定尿中的6β-OHF和FC含量，流動相B選用硫酸銨，可以減小峰寬，峰形較尖銳對稱，當6β-OHF濃度較大時可以減輕前伸峰。本法的建立及尿液中6β-OHF和FC比值的測定，可為進一步研究CYP3A4酶的作用機制和某些藥物對該酶活性的影響提供參考。

本研究以市售硝苯地平片為參比制劑，比較了自制硝苯地平緩釋微丸和市售制劑的體內(nèi)藥物動力學(xué)行為。從平均血藥濃度-時間曲線圖可以看出，市售片的平均達峰時間tmax為1.50 h，而緩釋微丸的平均達峰時間為8.00 h，較市售制劑顯著延遲，且緩釋微丸的MRT較市售制劑顯著增加(P<0.005)，cmax和t1/2顯著降低(P<0.005)，AUC0-∞無差異(P=0.467)，說明緩釋微丸在體內(nèi)具有明顯的緩釋效果。

本研究試圖以CYP3A4代謝酶活性差異角度為出發(fā)點，解釋硝苯地平制劑體內(nèi)個體差異的原因。隨著CYP3A4活性的增強，硝苯地平緩釋微丸的一些主要藥代動力學(xué)參數(shù)呈一定趨勢的改變，如清除率CL變大，AUC減小，cmax減小。實驗發(fā)現(xiàn)CYP3A4活性與硝苯地平緩釋微丸藥代動力學(xué)參數(shù)的相關(guān)性較好，可能由于市售組為速釋片，藥物在最初階段大量吸收進入體內(nèi)后，代謝藥物的CYP3A4酶達到飽和狀態(tài)；而緩釋微丸釋藥緩慢，藥物緩慢進入體內(nèi)后CYP3A4酶并未達到飽和狀態(tài)，藥物能被充分代謝，故CYP3A4活性與緩釋微丸的幾個藥代動力學(xué)參數(shù)相關(guān)性較好。兩種制劑的相關(guān)藥代動力學(xué)參數(shù)均隨CYP3A4活性改變而變化的實驗結(jié)果表明，CYP3A4活性可以影響硝苯地平在體內(nèi)代謝的程度，進而改變其全身清除率及生物利用度等。

由于不同個體間CYP3A4代謝酶的活性不同，對于硝苯地平的清除率也不同，若CYP3A4活性過高，則硝苯地平在其體內(nèi)代謝速率增加，全身清除率隨之增加。此外，肝臟是CYP3A4存在和作用的主要場所，若其活性過高，藥物口服給藥后的首過效應(yīng)會增加，生物利用度也會明顯降低，因此需要根據(jù)實際情況調(diào)整給藥方案以達到理想的治療效果。通過監(jiān)測CYP3A4基因的多態(tài)性及酶活性，可以針對不同人群不同患者制定相應(yīng)的給藥方案。