SFRP2單克隆抗體對腎癌SNU349細(xì)胞增殖及遷移的影響

沈 超，吳小榮，沙建軍，陳勇輝，薛 蔚，黃翼然，劉東明

(上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬仁濟(jì)醫(yī)院泌尿外科，上海 200127)

腎細(xì)胞癌(renal cell carcinoma，RCC)亦稱腎癌，是常見的泌尿系統(tǒng)腫瘤，約占腎臟惡性腫瘤的80%～90%，成人惡性腫瘤的2%～3%[1]。腎透明細(xì)胞癌(clear cell renal cell carcinoma，ccRCC)是腎癌中最常見的病理類型，約占腎癌的70%～85%[2]。目前手術(shù)是腎癌的主要治療手段，然而約20%～30%的局限性腎癌患者術(shù)后仍將發(fā)展為轉(zhuǎn)移癌[3]。晚期腎癌對傳統(tǒng)化療及放療敏感性均較低。近年來，分子靶向治療的不斷發(fā)展使之成為了晚期腎癌的重要治療手段[4]。然而靶向治療依然存在毒副作用及耐藥相關(guān)問題[5-6]。因此，研究腎癌分子機(jī)制，尋找特異性治療靶點對腎癌治療及預(yù)后至關(guān)重要。

Wnt信號通路是一條進(jìn)化上相對保守的信號通路，其生物學(xué)效應(yīng)對腫瘤的增殖、遷移和侵襲密切相關(guān)[7]。分泌型卷曲相關(guān)蛋白2 (secreted frizzled related proteins 2,SFRP2) 是由SFRP2基因編碼的分泌型糖蛋白，其分子結(jié)構(gòu)中具有一個獨特的N-端胞外半胱氨酸富集區(qū)(cysteine-rich extracellular domain，CRD)結(jié)構(gòu)，該結(jié)構(gòu)與Frizzled(Fz)蛋白的CRD區(qū)域同源，而后者是公認(rèn)的Wnt結(jié)合位點[8]。本研究采用基因芯片分析及實時熒光定量PCR方法檢測SFRP2在ccRCC中的表達(dá)情況，同時采用細(xì)胞增殖試驗、劃痕試驗檢測不同濃度SFRP2單克隆抗體對SFRP2高表達(dá)株SNU349細(xì)胞體外增殖、遷移的影響，為ccRCC靶點治療提供新的思路。

1 材料與方法

1.1研究對象收集本中心2016年2月～2017年1月術(shù)后病理診斷為ccRCC組織標(biāo)本37例。所選標(biāo)本患者術(shù)前均未接受化療、放療或其他抗癌治療，均無腎細(xì)胞癌家族史。所選標(biāo)本患者年齡22～81歲，平均52.1歲，其中男性20例(54.1%)，女性17例(45.2%)。腫瘤直徑2.6～7.1 cm，平均3.9 cm。臨床分期依據(jù)2010年美國癌癥聯(lián)合委員會(American Joint Committeeon Cancer，AJCC)對腎癌的TNM分期，T1期26例，T2期7例，T3期4例，其中2例下腔靜脈癌栓伴腎門淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移。另收集同期正常腎臟組織(距離癌組織5 cm以外) 10例作為對照，所有組織標(biāo)本獲取后即冷凍于液氮中。

1.2材料腎癌細(xì)胞株SNU349(上海皓元生物醫(yī)藥科技有限公司)；SFRP2 mAb由本實驗室克隆篩選獲得；Balb/c小鼠(揚州大學(xué)比較醫(yī)學(xué)中心)；高糖DMEM(Gibco公司)；弗氏佐劑(sigma公司)；RNA提取試劑Trizol(Invitrogen公司)；RT試劑盒(Fermentas公司)；Premix Taq Version 2.0 PCR擴(kuò)增試劑盒(TaKaRa公司)；DEPC水(上海碧云天生物有限公司)；引物均由上海生工生物技術(shù)有限公司合成。

1.3方法

1.3.1基因芯片分析 CcRCC微陣列數(shù)據(jù)及相應(yīng)臨床資料提取自ArrayExpress數(shù)據(jù)庫[9]?；虮磉_(dá)譜應(yīng)用GeneChip human genome U133 Plus 2.0 array完成。運用基因顯著性分析(significance analysis of microarrays，SAM) 檢測T1～T4期ccRCC中SFRP2的表達(dá)。

1.3.2實時熒光定量多聚核苷酸鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(real-time quantitative polymerase chain reaction，qRT-PCR) 利用Trizol試劑提取組織總RNA，依照Premix Taq Version 2.0 PCR擴(kuò)增試劑盒步驟，反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。PCR反應(yīng)體系為20 μL，擴(kuò)增條件：95 ℃預(yù)變性30 s，然后95 ℃變性 5 s，58 ℃ 退火30 s，72 ℃ 延伸30 s，共40個循環(huán)。選擇ccRCC穩(wěn)定表達(dá)基因HMBS、PPIA、ATP5J和TBP為混合內(nèi)參。實時定量PCR結(jié)果以ΔCt分析。計算公式：ΔCt(目標(biāo)基因)=Ct (目標(biāo)基因) - GM{Ct(HMBS)，Ct(PPIA)，Ct(ATP5J)，Ct(TBP)}。

1.3.3SFRP2單克隆抗體制備 選擇并合成SFRP2特異性抗原peptide B(序列：EITYINRDTKIILETKSKTC)多肽，偶聯(lián)血藍(lán)蛋白(keyhole limpet hemocyanin，KLH)載體蛋白，選取5只6～8周齡雌性BALB/c小鼠，將peptide B-KLH多肽與弗氏佐劑混合免疫，皮下注射100 μg，2～3周加強免疫一次。間接酶聯(lián)免疫吸附劑測定法(enzyme linked immunosorbent assay，ELISA)確定抗血清針對peptide B多肽效價，待效價檢測正常后進(jìn)行細(xì)胞融合。制備骨髓瘤細(xì)胞及脾細(xì)胞，以數(shù)量比1∶20混合。加入HAT DMEM培養(yǎng)基，鋪于96孔板中，每孔100 μL，CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。融合10 d后進(jìn)行篩選檢測。根據(jù)ELISA結(jié)果，以樣品孔吸光度(absorbance,A)值/陰性孔A值≥2.1判定陽性孔，選擇陽性孔細(xì)胞加DMEM鋪于96孔板，重復(fù)亞克隆，挑出單克隆孔擴(kuò)大培養(yǎng)定株。取蛋白A瓊脂糖介質(zhì)，填裝層析柱，將腹水與磷酸緩沖鹽溶液(phosphate buffer saline，PBS)按1∶1混勻后緩慢上樣，待抗體結(jié)合后用甘氨酸洗脫緩沖液洗脫。純化抗體后立即在PBS中進(jìn)行4度透析過夜。純化后抗體行聚丙烯酰胺凝膠電泳(sodiumdodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE)，考馬斯亮藍(lán)染色測定純度。

1.3.4細(xì)胞增殖試驗 取對數(shù)生長期腎癌SNU349細(xì)胞以每孔5×103個種于96孔板，每孔體積200 μL，培養(yǎng)24 h；更換培養(yǎng)基，每孔分別加入50、100及200 μg/mL的SFRP2 mAb，對照組加入同體積PBS，實驗組和對照組均設(shè)8個復(fù)孔，孵育24 h和48 h ；在96孔板中每孔加入噻唑藍(lán)(MTT)溶液(5 mg/mL)20 μL，避光孵育4 h；棄上清，每孔加入DMSO 150 μL，振蕩5 min；選擇570 nm波長，在酶聯(lián)免疫監(jiān)測儀上測定各孔吸光度，記錄結(jié)果，并計算抑制率。

計算公式：細(xì)胞生長抑制率(inhibition ratio，IR)=(1-實驗組平均A值/對照組平均A值)×100%。

1.3.5劃痕試驗 取對數(shù)生長期腎癌SNU-349細(xì)胞配置成單個細(xì)胞懸液，并接種于6孔板；用10 μL 移液槍槍頭在培養(yǎng)板中以垂直方向劃寬度約1 mm劃痕；分組給予50、100、200 μg/mL的SFRP2 mAb處理，對照組加入同體積PBS，實驗組和對照組均設(shè)4個復(fù)孔，孵育24 h及48 h；倒置熒光顯微鏡下觀察并拍照，Image-Pro Plus 軟件測量劃痕區(qū)相對距離并計算細(xì)胞遷移率。

計算公式：遷移率(%)=(mAb干預(yù)前劃痕區(qū)相對距離-mAb干預(yù)后劃痕區(qū)相對距離) /mAb干預(yù)前劃痕區(qū)相對距離×100%

1.4統(tǒng)計學(xué)分析采用SPSS 13.0統(tǒng)計軟件處理數(shù)據(jù)，連續(xù)變量組間比較采用t檢驗，P<0.05表示有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1基因芯片顯著性分析結(jié)果依據(jù)E-GEOD-53757 數(shù)據(jù)庫，223121_s_at(SFRP2)在T1～T4期ccRCC中基因探針信號強度分布如圖1所示。數(shù)據(jù)顯示，SFRP2在ccRCC各分期中表達(dá)無顯著差異，但在部分T1、T2及T4ccRCC中信號強度顯著增高，提示部分ccRCC中可能高表達(dá)SFRP2。

圖1 E-GEOD-53757 數(shù)據(jù)庫，223121_s_at(SFRP2)在T1～T4期ccRCC中基因探針信號強度分布

2.2qRT-PCR驗證SFRP2在ccRCC及癌旁正常組織中的表達(dá)為進(jìn)一步驗證基因芯片提示結(jié)果，本研究運用qRT-PCR技術(shù)檢測37例ccRCC組織及10例癌旁正常組織中SFRP2的表達(dá)。結(jié)果顯示在部分ccRCC組織中，ΔCt 值顯著降低，其差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，證實在部分ccRCC中SFRP2表達(dá)程度顯著增高(圖2)。

2.3SFRP2mAb的制備及純化純化后抗體行SDS-PAGE電泳，分別于相對分子質(zhì)量為55和25處呈現(xiàn)2條帶，抗體純度在90%以上(圖3)。

2.4不同濃度SFRP2mAb對腎癌SNU349細(xì)胞增殖的影響對照組中腎癌SNU349細(xì)胞生長良好，輪廓清晰，呈貼壁匯合狀，細(xì)胞形態(tài)以梭形為主，少量細(xì)胞呈圓形。SFRP2 mAb 實驗組中，隨單克隆抗體濃度提升及實驗時間增長，細(xì)胞皺縮、脫落明顯增加，細(xì)胞形態(tài)紊亂，生長受抑(圖4A)。MTT結(jié)果顯示，與對照組相比，實驗組均表現(xiàn)出顯著增殖抑制作用(P<0.05)，SFRP2 mAb 對SNU349細(xì)胞增殖抑制率隨單克隆抗體濃度增加及作用時間延長而提升(圖4B)，其中當(dāng)SFRP2 mAb濃度為200 μg/mL，作用時間為48 h時其抑制效果最明顯(P=0.006)。同時，24 h及48 h抑制率與抗體濃度的相關(guān)系數(shù)(r)分別為0.859和0.857,提示其抑制作用呈先一定濃度依賴性。

圖2 qRT-PCR檢測SFRP2在ccRCC及癌旁正常組織中的表達(dá)結(jié)果

圖3 SDS-PAGE 電泳分析抗體腹水純化后的純度

圖4 不同濃度及時間作用下SFRP2 mAb對SNU349細(xì)胞增殖的影響

A：SFRP2 mAb對SNU349細(xì)胞形態(tài)的影響；B：SFRP2 mAb對SNU349細(xì)胞抑制率的影響。

2.5不同濃度SFRP2mAb對SNU349細(xì)胞遷移的影響劃痕實驗結(jié)果顯示，SFRP2 mAb能有效抑制SNU349細(xì)胞劃痕愈合(圖5A)。統(tǒng)計結(jié)果顯示，與對照組相比，在SFRP2 mAb 作用后，SNU349細(xì)胞的遷移能力顯著下降(P<0.05)，SUN349細(xì)胞遷移率隨SFRP2 mAb濃度上升而降低(圖5B)，其中當(dāng)SFRP2 mAb濃度為200 μg/mL時抑制效果最為顯著(P=0.009)。

圖5不同濃度及時間作用下SFRP2mAb對SNU349細(xì)胞遷移的影響

A： SFRP2 mAb對SNU349細(xì)胞遷移形態(tài)的影響；B： SFRP2 mAb對SNU349遷移率的影響。

3 討 論

RCC是泌尿系統(tǒng)常見腫瘤之一，且發(fā)病率呈逐年上升趨勢。早期腎癌常常因臨床表現(xiàn)不明顯而被患者忽視，據(jù)統(tǒng)計約25%～30%的患者在臨床就診時已經(jīng)有轉(zhuǎn)移，而出現(xiàn)轉(zhuǎn)移的晚期腎癌患者的5年生存率僅有10%[10]。晚期RCC對于傳統(tǒng)放療及化療均不敏感。而以白細(xì)胞介素-2(interleukin-2，IL-2)、干擾素-α(interferon-α，IFN-α) 等為代表的細(xì)胞因子治療其有效率不及20%，同時伴隨較多毒副作用[11]。近年來，分子靶向治療成為了晚期RCC治療研究的熱門領(lǐng)域。然而靶向治療藥物依然存在手足皮膚反應(yīng)、消化道反應(yīng)、極度乏力等不良反應(yīng)[12]。因此，積極探討RCC發(fā)生、發(fā)展的分子機(jī)制，尋找高特異性治療靶點對于晚期RCC的治療具有至關(guān)重要的臨床價值。

SFRP2屬于分泌型卷曲相關(guān)蛋白家族組SFRPs的一員，其N端在結(jié)構(gòu)上具有一個獨特的半胱氨酸富集區(qū)(cysteine-rich domain，CRD)，與Wnt信號傳導(dǎo)通路中的特異性受體Fz受體具備高度同源性[13]。因此SFRP2通常被認(rèn)為可以通過競爭性結(jié)合等方式實現(xiàn)對Wnt信號傳導(dǎo)通路的負(fù)調(diào)節(jié)，進(jìn)而減少β-catenin的激活，最終抑制腫瘤增殖[14]。許多研究證實了SFRP2表達(dá)下調(diào)在不同腫瘤發(fā)生發(fā)展中的重要作用，而其啟動子CpG島的甲基化則被認(rèn)為是導(dǎo)致SFRP2基因表達(dá)下調(diào)的關(guān)鍵因素[15]。KINOSHITA等[16]對胃癌中SFRP2基因表達(dá)及其甲基化狀態(tài)進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)在胃癌中SFRP2啟動子超甲基化導(dǎo)致其表達(dá)下調(diào)，進(jìn)而促進(jìn)腫瘤生成及其轉(zhuǎn)移侵襲能力。TANAKA等[17]對51例人結(jié)直腸癌患者中SFRP2表達(dá)情況進(jìn)行研究，亦得出相似結(jié)論，認(rèn)為SFRP2超甲基化在結(jié)直腸癌發(fā)生發(fā)展中起促進(jìn)作用。然而近年來，亦有相關(guān)研究得出完全相反的結(jié)論：在犬類乳腺癌的相關(guān)研究中發(fā)現(xiàn)，相較于正常乳腺組織，SFRP2在腫瘤組織中顯著增加，高濃度SFRP2降低了紫外線誘導(dǎo)凋亡的敏感性，同時增強了腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)化能力[18]。ROTH等[19]研究發(fā)現(xiàn)，在腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞中，SFRP2的異位表達(dá)可以顯著促進(jìn)裸鼠顱內(nèi)移植瘤的生長。LEE等[20]研究認(rèn)為，SFRP2可能通過激活NF-kappaB傳導(dǎo)通路或是抑制JNK傳導(dǎo)通路實現(xiàn)抗腫瘤凋亡作用；其研究亦指出SFRP2與纖連蛋白整合素蛋白復(fù)合體(fibronectin-integrin protein complex)的結(jié)合可能也是導(dǎo)致其誘導(dǎo)細(xì)胞黏連及抗凋亡的原因之一。因此，在部分腫瘤中，SFRP2亦可扮演促癌基因的角色。

本研究中運用基因芯片技術(shù)以及實時熒光定量PCR技術(shù)檢測SFRP2在腎透明細(xì)胞癌及癌旁正常組織中的表達(dá)。結(jié)果顯示，SFRP2在部分腎透明細(xì)胞癌中顯著高表達(dá)(P<0.05)。研究結(jié)果提示在部分腎透明細(xì)胞癌中SFRP2高表達(dá)可能在其誘導(dǎo)增殖中起重要作用。為驗證該假設(shè)，本研究首次運用SFRP2 mAb技術(shù)，檢測不同濃度抗體對SFRP2高表達(dá)株腎癌SNU349細(xì)胞體外增殖及遷移的影響。結(jié)果顯示，SFRP2 mAb可以有效抑制腎癌SNU349細(xì)胞體外增殖及遷移，其作用效果呈現(xiàn)濃度依賴性。

目前，關(guān)于SFRP2促瘤機(jī)制并無明確定論，研究成為主要為以下3種假設(shè)：①SFRP2同時具備高親和力及低親和力的結(jié)合位點。當(dāng)受體與其高親和力位點結(jié)合時表現(xiàn)為對Wnt信號傳導(dǎo)通路的增強效應(yīng)，當(dāng)?shù)陀H和力位點與受體結(jié)合時則表現(xiàn)為抑制效應(yīng)[21]。②SFRP2在高濃度情況下，可以與Fz受體結(jié)合形成無功能復(fù)合物[22]。③SFRP2在高濃度Fz受體環(huán)境下促進(jìn)Wnt蛋白轉(zhuǎn)運從而激活信號傳導(dǎo)通路，在低濃度Fz受體環(huán)境下則表現(xiàn)為通路拮抗劑[23]。因此，SFRP2在不同腫瘤中所表現(xiàn)出截然不同的效應(yīng)可能與其遺傳多態(tài)性以及不同的細(xì)胞微環(huán)境密切相關(guān)。YAMAMURA等[24]在對腎癌中SFRP2表達(dá)的研究中得出與本研究類似結(jié)論：SFRP2的穩(wěn)定表達(dá)可以促進(jìn)體內(nèi)及體外腎細(xì)胞癌增殖，同時減少紫外線誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡，增長細(xì)胞G2期。SFRP2的表達(dá)顯著活化T細(xì)胞因子/淋巴增強子轉(zhuǎn)錄活動，增加c-Fos、Bcl2、Bcl-w，cyclin B2和cyclin E2基因表達(dá)同時減少p53基因表達(dá)。

近年來，以SFRP2為靶點的分子靶向治療研究不斷升溫。FONTENOT[25]等將SFRP2 mAb運用于血管肉瘤及三陰乳腺癌(指雌激素受體、孕激素受體、人表皮生長因子受體2，三者均為陰性的乳腺癌)中，結(jié)果顯示SFRP2 mAb能夠有效抑制體外血管生成、細(xì)胞增殖及遷移，同時能有顯著抑制體內(nèi)血管肉瘤及三陰乳腺癌模型的增長。他們認(rèn)為SFRP2在血管肉瘤及三陰乳腺癌中扮演促癌基因的角色，同時提出了SFRP2 mAb成為這兩類腫瘤特異性靶向治療藥物的可能性。本研究中SFRP2 mAb有效抑制SFRP高表達(dá)株腎癌SNU349細(xì)胞的體外增殖及遷移亦提示SFRP2在部分高表達(dá)SFRP2的腎癌中成為治療靶點的可能前景。

綜上所述，SFRP2在部分ccRCC中表達(dá)明顯升高。SFRP2 mAb可顯著抑制腎癌SNU349細(xì)胞體外增殖及遷移，且抑制程度與mAb濃度成正相關(guān)關(guān)系。研究結(jié)果提示SFRP2高表達(dá)可能與部分腎透明細(xì)胞癌誘導(dǎo)生成及腫瘤發(fā)展密切相關(guān)，SFRP2可能是腎透明細(xì)胞癌的早期預(yù)防診斷以及預(yù)測腫瘤的復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移及預(yù)后有價值的分子標(biāo)志物。同時，SFRP2 mAb可能成為部分SFRP2過表達(dá)的ccRCC的有效治療靶點。