大蒜素聯(lián)合5-FU對結腸癌HT-29細胞凋亡的影響及機制

邵佳月 孫秀威

結腸癌是癌癥死亡的第二常見原因[1]。結直腸癌化學治療的主要用藥是5-fluorouracil(5-FU)和奧沙利鉑。結腸癌有較高的復發(fā)率和轉移率。II期結腸癌患者手術后的復發(fā)率約20%～30%。此外，一些III期癌癥患者接受化學治療無效，所以嘗試聯(lián)合用藥迫在眉睫。大蒜素是大蒜的主要活性成分之一，是大蒜中最具生物活性的化合物之一，大蒜具有多種生物活性，包括抗動脈粥樣硬化，降壓、抗菌、抗癌、免疫調節(jié)、抗輻射以及潛在的抗衰老作用[2-3]。大蒜素是新鮮大蒜的主要成分，是由蒜氨酸通過酶作用形成的[4-5]。大蒜素對胃癌、結腸癌、肝癌、肺癌等多種腫瘤細胞有明顯的抑制作用，已作為臨床輔助藥物進入臨床治療，激活凋亡信號通路可能是治療惡性腫瘤的有效途徑，但大蒜素發(fā)揮其凋亡作用的機制尚不完全清楚[6]。鑒于結腸癌的高發(fā)病率及大蒜素在腫瘤治療中的重要作用，本實驗旨在探討大蒜素與5-FU聯(lián)合應對結腸癌HT29細胞的生長抑制和誘導凋亡作用機制。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

青霉素、鏈霉素和胰酶購自Hyclone公司；胎牛血清、1640培養(yǎng)液與HT29細胞購自上海中橋新舟公司；CCK-8試劑盒購自日本Dojindo公司；大蒜素購自大連美倫公司；5-FU購自Sigma公司；光學顯微鏡購自日本Olympus公司；酶標儀購自瑞士TECAN公司；Direct DetectTMSpectrometer-Sample Measuring紅外微定量分析儀購自德國Merck Millipore公司；實時熒光定量PCR儀購自德國Roche公司。

1.2 細胞培養(yǎng)

將結腸癌HT29細胞株置于含10% FBS及1%雙抗的1640培養(yǎng)基中，置于含5% CO2、37℃飽和濕度的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，2～3天換一次液，待細胞鋪滿培養(yǎng)瓶底面積80%以上對細胞進行傳代，采用對數生長期的細胞進行后續(xù)實驗。

1.3 CCK-8檢測HT29細胞增殖情況

收集對數生長期HT29細胞，以每孔4 000個加入96孔板，每孔100 μL。將不同質量濃度(2～30 μg/mL)的藥物(5-FU、大蒜素)各100 μL加入實驗孔，另設立不加藥的陰性對照。每一濃度設4個復孔，培養(yǎng)48 h。每孔加入10 μL的CCK-8繼續(xù)孵育3 h，酶標儀檢測490 nm處吸光度值。

1.4 流式細胞術檢測HT29細胞凋亡情況

取對數生長期HT29細胞，接種于6孔板待細胞平鋪于瓶底80%～90%后，將不同質量濃度(2～30 μg/mL)的藥物(5-FU、大蒜素)各1000 μL加入實驗孔，另設立不加藥的陰性對照。每一濃度設4個復孔，培養(yǎng)48 h后，用不含EDTA的胰酶消化后收集細胞，用預冷PBS重懸細胞一次，2 000 rpm離心5～10 min，棄上清洗滌細胞；加入300 μL的1×Binding Buffer懸浮細胞，將細胞濃度調整至5×106/mL；取195 μL細胞懸液，加入5 μL的Annexin V-FITC混勻后，避光，室溫孵育15 min；上機前5 min再加入5 μL的PI染色，補加200 μL的1×Binding Buffer。

1.5 實時PCR檢測HT29細胞中相關mRNA表達

將HT29細胞平鋪于24孔培養(yǎng)板，待細胞融合至80%左右將細胞隨機分為空白對照組、大蒜素組、5-FU組、大蒜素+5-FU組，加藥后繼續(xù)培養(yǎng)48 h，棄上清液，PBS洗兩次，收集不同組別的HT29細胞加入TRIzol裂解液，提取總RNA，并按照逆轉錄試劑盒的說明將提取的總mRNA逆轉錄成cDNA，用于實時定量PCR檢測，采用標準曲線法計算mRNA相對量。

引物序列由上海生工生物工程有限公司合成，引物序列：PTEN：5-ACACCGCCAAATTTAACTGC-3，5-TGAGGTTTCCTCTGGTCCTG-3；mTOR：5-GATTCTCACAACCCAGCGTG-3，5-CGTTAAGGATCAACAAGGCT-3；Bcl-2：5-ATTGGGAAGTTTCAAATCAGC-3，5-TGCATTCTTGGAC GAGGG-3；Bax：5-TTTTGCTTCAGGGTTTCATC-3，5-GACACTCGCTCAGCTTCTTG-3；GAPDH：5-ATCACCATCTTCCAGGAGCGA-3，5-GCCAGTGAGCTTCCCGTTCA-3。

1.6 統(tǒng)計分析

2 結果

2.1 大蒜素聯(lián)合5-FU對HT29細胞增殖抑制作用的影響

分別加入質量濃度為2，5，10，15，20，25，30 μg/mL大蒜素、5-FU與5-FU聯(lián)合大蒜素處理HT29細胞48 h。CCK-8法檢測其對HT29細胞增殖作用影響結果顯示，不同濃度的大蒜素對HT29細胞抑制作用隨著濃度的增加抑制作用逐漸增大，差異具有統(tǒng)計學意義；不同濃度的5-FU對HT29細胞抑制作用隨著濃度的增加抑制作用逐漸增大，差異具有統(tǒng)計學意義；不同濃度大蒜素+5-FU對HT29細胞抑制作用隨著聯(lián)合濃度的增加抑制作用逐漸增大；與相應濃度大蒜素和5-FU單獨濃度比較，大蒜素+5-FU組對HT29細胞抑制作用明顯大于大蒜素組和5-FU組，差異具有統(tǒng)計學意義。后續(xù)實驗選取大蒜素、5-FU與5-FU聯(lián)合大蒜素終濃度均為15 μg/mL(表1)。

2.2 大蒜素聯(lián)合5-FU對HT29細胞凋亡情況的影響

流式細胞術檢測結果顯示，與空白對照組比較，大蒜素組、5-FU組和大蒜素+5-FU組均能夠促進HT29細胞的凋亡，差異具有統(tǒng)計學差異(P<0.01)；與大蒜素組和5-FU組比較，大蒜素+5-FU組能夠明顯促進HT-29細胞的凋亡，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)(圖1，表2)。

圖1 HT29細胞凋亡情況Figure 1 Apoptotic cells were determined in HT29 cells by flow cytometry

表1 大蒜素與5-FU對HT29細胞增殖抑制率

2.3 大蒜素聯(lián)合5-FU對HT29細胞mTOR、PTEN、Bcl-2與Bax mRNA表達的影響

與空白對照組比較，大蒜素組、5-FU組和大蒜素+5-FU組處理的HT29細胞中PTEN和Bax mRNA的表達明顯增加，mTOR和Bcl-2的mRNA的表達明顯降低，差異均具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；與大蒜素組、5-FU組比較，大蒜素+5-FU組中PTEN和Bax的mRNA的表達明顯增加，mTOR和Bcl-2的mRNA的表達明顯降低，差異均具有統(tǒng)計學差異(P<0.05)(表3)。

表2 各組細胞凋亡率的比較Table 2 The apoptosis rates in each

表3 HT29細胞中mTOR、PTEN、Bcl-2與Bax表達Table 3 The expression of mTOR，PTEN，Bcl-2 and Bax mRNA in HT29

3 討論

結腸癌是全球最常見的惡性腫瘤之一，目前主要采用手術、放化療和靶向治療。5-FU和蒽環(huán)類是常用于治療結腸癌的化療藥物，但療效往往不佳，容易產生耐藥性，主要原因是腫瘤對化療藥物產生的抵抗反應，因此本實驗嘗試大蒜素與5-FU聯(lián)合應用來達到低毒高效的目的。

大蒜素是一個最暢銷的草藥產品，是有機含硫化合物的天然來源，最近研究最多的是關于它們的治療應用。作為大蒜的活性成分，大蒜素具有廣泛的藥理活性包括抗癌、抗血小板、抗菌、降血脂和預防作用[7]。大蒜素對胃癌、結腸癌、肝癌、肺癌等多種腫瘤細胞有明顯的抑制作用，已作為輔助藥物進入臨床治療，激活凋亡信號通路可能是治療惡性腫瘤的有效途徑。

研究表明，Bcl-2家族成員(如Bax、Bcl-xL、Mcl-1、Bcl-2)位于線粒體膜，線粒體膜的通透性改變引發(fā)caspase激活，從而導致細胞凋亡[8]。在非caspase依賴的凋亡途徑中發(fā)現(xiàn)大蒜素誘導人上皮癌細胞凋亡通過線粒體釋放誘導因子(AIF)和蛋白激酶A[9]。PTEN、PI3K涉及信號轉導通路在細胞生長和死亡調控中的核心作用[10]，其通路是癌細胞轉移潛能的基礎，為靶向PI3K/Akt通路提供了有力的理論依據[11]。PTEN基因是PI3K/Akt信號通路的負調控因子[12]。而mTOR是一個集成了生長因子和激素的多個信號的絲氨酸/蘇氨酸激酶，其控制細胞生長、增殖、血管生成[13]。mTOR調控細胞生長，在PI3K/Akt/mTOR信號通路中處于中心地位。mTOR可通過調控蛋白質磷酸化過程，促進細胞增殖與分化[14]。PTEN通過抑制PI3K/Akt信號通路 反向調節(jié)mTOR，Akt磷酸化上調mTOR活性，失調的mTOR參與腫瘤形成、血管生成和耐藥[13]。一般癌癥患者中mTOR信號通路的激活與腫瘤分化程度及預后息息相關，而表皮生長因子和PTEN通路能夠抑制其作用[15]。腫瘤細胞無限制生長的重要原因就是其生理性和主動性凋亡的能力的喪失，因此有效的抗腫瘤藥物治療不僅要抑制腫瘤細胞增殖，而且要誘導腫瘤細胞凋亡。

體外細胞試驗顯示，5-FU與大蒜素聯(lián)合對比單獨用藥可以提高HT29細胞凋亡率?；蛩綑z測顯示5-FU與大蒜素聯(lián)合應用可以通過下調Bcl-2表達與上調Bax表達誘導細胞凋亡。大蒜素與5-FU聯(lián)合下調mTOR表達，提高抑癌基因PTEN基因表達，對比單獨給藥具有統(tǒng)計學差異。

綜上所述，大蒜素有促進5-FU對HT29細胞的致凋亡作用，能增加HT29細胞對化療藥物的敏感性，對結腸癌的治療以及預后都起著積極的作用，值得進一步進行臨床研究。