PD-1、CTLA-4、BLTA在食管鱗狀細(xì)胞癌患者外周血中的表達(dá)及臨床意義

郝 賀 李 幸 吳玲彥 郭曉金 曹 靜 楊春旺 張 曉 汪治宇

近年來(lái)，隨著腫瘤免疫學(xué)的發(fā)展，人們逐漸認(rèn)識(shí)到腫瘤生長(zhǎng)過(guò)程中會(huì)產(chǎn)生免疫抑制環(huán)境，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞逃逸。其中，抑制性協(xié)同刺激因子受體在腫瘤免疫逃逸中發(fā)揮著重要作用[1-3]。程序性死亡分子1(Programmed cell death 1，PD-1)、細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞相關(guān)抗原(Cytotoxic T lymphocyte associated antigen-4，CTLA-4)、B和T淋巴細(xì)胞衰減蛋白(B and T lymphocyte attenuator，BTLA)是目前研究較熱的抑制性協(xié)同刺激因子受體，其與相應(yīng)配體結(jié)合后產(chǎn)生的負(fù)性信號(hào)可抑制T淋巴細(xì)胞的激活、增殖及細(xì)胞因子分泌，減弱宿主的抗腫瘤免疫反應(yīng)[4-6]。目前，抗PD-1、CTLA-4單藥或聯(lián)合用藥已經(jīng)獲批用于臨床治療黑色素瘤、腎癌及非小細(xì)胞肺癌等腫瘤，并獲得明顯的療效[7]，針對(duì)阻斷BTLA靶點(diǎn)的研究正在進(jìn)行[8]。鑒于腫瘤微環(huán)境的復(fù)雜性及PD-1、CTLA-4、BTLA作用機(jī)制的不同，在同一個(gè)體中，PD-1、CTLA-4、BTLA表達(dá)情況如何，三者之間是否具有一定相關(guān)性，我們不得而知。本研究以食管鱗狀細(xì)胞癌患者及健康人作為研究對(duì)象，通過(guò)檢測(cè)和對(duì)比患者及健康人外周血中可溶性PD-1(Soluble PD-1，sPD-1)、可溶性CTLA-4(Soluble CTLA-4，sCTLA-4)及可溶性BTLA(Soluble BTLA，sBTLA)表達(dá)水平，并結(jié)合臨床病理特征及手術(shù)干預(yù)對(duì)其表達(dá)的影響，探討其與食管鱗狀細(xì)胞癌發(fā)生發(fā)展的關(guān)系，并分析三者之間的相關(guān)性及作為生物標(biāo)記物的臨床價(jià)值。

1 材料與方法

1.1 研究對(duì)象

選取2016年6月—2017年4月河北醫(yī)科大學(xué)第四醫(yī)院胸外科收治的食管鱗狀細(xì)胞癌患者90例。其中男59例，女31例；年齡43～90歲，中位年齡65歲。納入標(biāo)準(zhǔn)：所有患者均經(jīng)病理檢查確診為食管鱗狀細(xì)胞癌，未進(jìn)行過(guò)手術(shù)、化療、放療或其他生物治療，且無(wú)全身免疫系統(tǒng)疾病。90名患者中行手術(shù)治療50例，其中男37例，女13例；年齡43～76歲，中位年齡63歲。術(shù)后TNM分期：Ⅰ期14例，Ⅱ期15例，Ⅲ期21例。對(duì)照組為同期本院體檢中心性別和年齡相匹配的健康體檢者40例，其中男25例，女15例；年齡54～76歲，中位年齡62歲。本研究中所有研究對(duì)象均知情同意并上報(bào)醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2 試劑及儀器

人sPD-1、sCTLA-4及sBLTA ELISA檢測(cè)試劑盒均購(gòu)自北京易科拜德科技有限公司；酶標(biāo)儀(儀器型號(hào)：DNM-9602)購(gòu)自北京普朗新技術(shù)有限公司；洗板機(jī)(儀器型號(hào)：AC8)購(gòu)自芬蘭Thermo Labsystems公司；TG16W微量高速離心機(jī)購(gòu)自長(zhǎng)沙湘智離心機(jī)有限公司；GNP-9080型隔水式恒培養(yǎng)箱購(gòu)自臺(tái)灣斯特儀器設(shè)備有限公司。

1.3 方法

1.3.1 標(biāo)本的收集及處理 所有研究對(duì)象均為清晨空腹采血，行手術(shù)患者均為術(shù)后第5天再次采血。用普通促凝真空采血管采靜脈血(外周血)5 mL，靜置30 min，3000×g離心10 min后取上清液，-80℃凍存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 血清中sPD-1、sCTLA-4及sBLTA的檢測(cè) 采用ELISA法檢測(cè)血清sPD-1、sCTLA-4及sBLTA的含量，操作步驟參照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。將sPD-1、sCTLA-4及sBLTA標(biāo)準(zhǔn)品依次稀釋，在96孔板中分別加入50 μL血清樣本或標(biāo)準(zhǔn)品，溫育30 min，清洗液洗2次，然后加入酶標(biāo)試劑50 μL，溫育30 min，每孔先加入顯色劑A 50 μL，再加入顯色劑B 50 μL，每孔加終止液50 μL反應(yīng)結(jié)束。酶標(biāo)儀讀取450 nm吸光度(OD)值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品吸光度繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，然后計(jì)算血清sPD-1、sCTLA-4及sBLTA的表達(dá)水平。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 18.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件對(duì)各組數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，兩組間比較使用兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)或配對(duì)t檢驗(yàn)，多組間的比較使用方差分析或秩和檢驗(yàn)，相關(guān)性分析采用Spearman秩相關(guān)分析，影響因素分析使用多因素線性回歸分析，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)。

2 結(jié)果

2.1 食管鱗癌組與正常人組血清中sPD-1、sCTLA-4及sBLTA表達(dá)水平

食管鱗癌組血清sPD-1、sCTLA-4及sBLTA水平均高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)(表1)。

2.2 食管鱗癌組手術(shù)前后血清中sPD-1、sCTLA-4及sBLTA表達(dá)水平

食管鱗癌組血清中sPD-1、sCTLA-4及sBLTA手術(shù)前后水平差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，說(shuō)明手術(shù)干預(yù)對(duì)sPD-1、sCTLA-4及sBLTA表達(dá)無(wú)影響(表2)。

表1 食管鱗癌組與正常人組血清中sPD-1、sCTLA-4及sBLTA表達(dá)水平Table 1 The serum levels of sPD-1，sCTLA-4 and sBLTA between ESCC and healthy control groups(pg·mL-1)

表2 食管鱗癌組手術(shù)前后患者血清中sPD-1，sCTLA-4及sBLTA表達(dá)水平Table 2 Serum levels of sPD-1，sCTLA-4 and sBLTA in patients between before and after surgery(pg·mL-1)

2.3 食管鱗癌患者血清中sPD-1、sCTLA-4及sBLTA表達(dá)水平與患者臨床病理特征相關(guān)性

sPD-1和sBLTA的表達(dá)水平與臨床病理特征無(wú)顯著關(guān)系，sCTLA-4的表達(dá)水平與TNM分期關(guān)系顯著(P<0.05)，與T分期、N分期、腫瘤體積大小、腫瘤部位、組織分化程度、性別、年齡無(wú)顯著性關(guān)系，提示相對(duì)于sPD-1和sBLTA，sCTLA-4在食管鱗癌分期變化中更為敏感，可能作為預(yù)測(cè)食管鱗狀細(xì)胞癌病情嚴(yán)重程度的生物學(xué)指標(biāo)(表3)。

表3 不同特征的食管鱗癌患者血清中sPD-1，sCTLA-4及sBLTA表達(dá)水平的比較Table 3 Correlation between the serum levels of sPD-1，sCTLA-4 and sBLTA and clinicopathological parameters

2.4 食管鱗癌患者血清中sPD-1，sCTLA-4及sBLTA表達(dá)水平的影響因素分析

分別以sPD-1、sCTLA-4和sBLTA作為因變量，以年齡、性別、T分期、N分期、TNM分期、腫瘤體積大小、腫瘤部位、組織分化程度作為自變量納入到多元線性回歸模型中，多元線性回歸模型分析結(jié)果顯示，性別、年齡、T分期、N分期、TNM分期腫瘤體積大小、腫瘤部位、組織分化程度均不是sPD-1、sCTLA-4和sBLTA表達(dá)水平的影響因素(P>0.05)(表4)。

表4 食管鱗癌患者血清中sPD-1，sCTLA-4及sBLTA表達(dá)水平的影響因素分析Table 4 Correlation between the serum levels of sPD-1，sCTLA-4 and sBLTA and clinicopathological parameters

2.5 食管鱗癌患者血清中sPD-1、sCTLA-4及sBLTA表達(dá)水平的相關(guān)性分析

將90例食管鱗狀細(xì)胞癌患者外周血sPD-1、sCTLA-4及sBLTA所測(cè)得數(shù)據(jù)行正態(tài)性分析，其數(shù)據(jù)呈現(xiàn)非正態(tài)分布，故行Spearman相關(guān)性分析，結(jié)果顯示，sPD-1、sCTLA-4及sBLTA兩兩之間無(wú)相關(guān)性，間接說(shuō)明了三者通過(guò)不同的信號(hào)通路調(diào)控免疫應(yīng)答(表5)。

表5 食管鱗癌患者血清中sPD-1，sCTLA-4及sBLTA表達(dá)水平的相關(guān)性Table 5 Correlation among the serum levels of sPD-1，sCTLA-4 and sBLTA

3 討論

T細(xì)胞的活化需要雙信號(hào)途徑，第一信號(hào)途徑為抗原遞呈細(xì)胞上的主要組織相容性復(fù)合體(Major histocompatibility complex，MHC)-抗原肽復(fù)合物與T細(xì)胞上的TCR結(jié)合，第二信號(hào)為抗原遞呈細(xì)胞上的共刺激分子B7與T細(xì)胞上的CD28分子結(jié)合。在這兩種信號(hào)共同作用下，T細(xì)胞活化、增殖，具備殺傷腫瘤細(xì)胞的能力。在第二信號(hào)通路中，存在激活性協(xié)同刺激因子受體及抑制性協(xié)同刺激因子受體，后者在負(fù)性調(diào)控T細(xì)胞應(yīng)答方面發(fā)揮重要作用[9-10]。PD-1、CTLA-4、BLTA是近年來(lái)研究較熱的負(fù)性共刺激信號(hào)分子。針對(duì)PD-1、CTLA-4靶點(diǎn)研發(fā)的單抗類藥物，如Nivolumab、Pembrolizumab、Pidiluzumab和Ipilimumab已經(jīng)在黑色素瘤、腎癌及非小細(xì)胞肺癌患者臨床治療中得以應(yīng)用，患者的生存期得以延長(zhǎng)。

然而，作為我國(guó)最常見(jiàn)的惡性腫瘤之一的食管癌，目前標(biāo)準(zhǔn)療法仍然限于手術(shù)或內(nèi)鏡切除及放化療，且總體預(yù)后較差。故有必要進(jìn)一步了解食管癌的分子發(fā)病機(jī)制，探索新的生物標(biāo)志物進(jìn)行靶向治療。目前為止，有關(guān)抑制性協(xié)同刺激因子受體在食管癌的報(bào)道開(kāi)始涌現(xiàn)。我國(guó)學(xué)者張鋒[11]指出食管鱗癌組織中PD-1在癌組織、癌旁組織、遠(yuǎn)癌組織中的陽(yáng)性表達(dá)率分別為56.9%、22.2%、3.0%，且PD-1陽(yáng)性表達(dá)率與食管癌患者腫瘤大小、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)，與年齡、性別、浸潤(rùn)深度、臨床分期、病理分級(jí)無(wú)關(guān)，然而Kim等[12]的研究表明食管鱗癌組織中PD-1的表達(dá)與臨床病理特征及其預(yù)后無(wú)相關(guān)性。筆者推測(cè)可能是組織中PD-1表達(dá)的異質(zhì)性、PD-1陽(yáng)性的定義及診斷所用抗體不同等因素造成。Zhang等[13]通過(guò)檢測(cè)食管鱗狀細(xì)胞癌手術(shù)標(biāo)本中腫瘤細(xì)胞及浸潤(rùn)性淋巴細(xì)胞中CTLA-4的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)87%的腫瘤細(xì)胞表達(dá)CTLA-4，在浸潤(rùn)性淋巴細(xì)胞中，58%的樣本為CTLA-4陽(yáng)性，且雙陽(yáng)性表達(dá)者與較差的總生存期相關(guān)。目前研究表明，這些共抑制因子受體除了在細(xì)胞膜上表達(dá)(膜型)外，還可以以可溶性形式存在于血清中，即可溶性抑制性協(xié)同刺激因子受體[14-16]。已有文章指出可溶性sPD-1、sCTLA-4及sBLTA能夠像細(xì)胞膜表面的分子一樣與受體相互作用發(fā)揮一定的生物學(xué)功能[17-19]。因此，本研究試圖探索可溶性協(xié)同刺激因子受體sPD-1、sCTLA-4及sBLTA在食管鱗狀細(xì)胞癌的表達(dá)及臨床意義，為食管鱗癌的免疫靶向藥物的研發(fā)提供理論依據(jù)。

本研究結(jié)果顯示，食管鱗癌組血清中sPD-1及sCTLA-4水平均高于正常人組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。BLTA作為一個(gè)新的免疫阻斷位點(diǎn)，本研究首次證實(shí)其在正常人組與食管鱗癌組表現(xiàn)出明顯的差異。針對(duì)手術(shù)患者，本研究發(fā)現(xiàn)腫瘤病灶經(jīng)手術(shù)切除后，sPD-1、sCTLA-4及sBLTA未出現(xiàn)明顯改變，推測(cè)這可能與檢測(cè)間隔較短(術(shù)后第5天)有關(guān)，甘濤等[20]通過(guò)檢測(cè)直腸癌根治術(shù)后第3天、第7天外周血CD3+、CD4+、CD8+、CD4+/CD8+及NK細(xì)胞活性，發(fā)現(xiàn)手術(shù)可抑制患者的免疫系統(tǒng)，術(shù)后應(yīng)激可造成外周血淋巴細(xì)胞總數(shù)下降，術(shù)后第7天較術(shù)后第3天以上指標(biāo)均有不同程度的回升。本研究中，sPD-1、sCTLA-4及sBLTA為抑制性協(xié)同刺激因子，在術(shù)后第5天機(jī)體可能依然處于應(yīng)激狀態(tài)，故其表達(dá)未發(fā)生明顯改變，若延長(zhǎng)監(jiān)測(cè)時(shí)間，結(jié)果可能會(huì)有所改變。在分析sPD-1、sCTLA-4及sBLTA水平與食管鱗癌病理特征相關(guān)性時(shí)，只有單因素分析中sCTLA-4表達(dá)與食管鱗癌患者的TNM分期有關(guān)，而與其它病理特征無(wú)相關(guān)性，提示相對(duì)于sPD-1和sBLTA，sCTLA-4在食管鱗癌分期變化中更為敏感，可能作為預(yù)測(cè)食管鱗狀細(xì)胞癌病情嚴(yán)重程度的生物學(xué)指標(biāo)。本研究發(fā)現(xiàn)sPD-1、sCTLA-4及sBLTA表達(dá)兩兩之間無(wú)相關(guān)性，間接說(shuō)明了三者通過(guò)不同的信號(hào)通路調(diào)控免疫應(yīng)答，同時(shí)為聯(lián)合應(yīng)用免疫位點(diǎn)阻斷藥物提供了一定的理論依據(jù)。

綜上所述，抑制性協(xié)同刺激因子受體在腫瘤免疫逃逸及免疫耐受過(guò)程中發(fā)揮重要作用。PD-1及CTLA-4抑制劑在黑色素瘤、腎癌及非小細(xì)胞肺癌等實(shí)體腫瘤中獲得了一定成功，但由于腫瘤免疫微環(huán)境的復(fù)雜性，免疫治療也存在無(wú)效或促進(jìn)腫瘤生長(zhǎng)等情況[21-23]。目前尚未找到確切的療效預(yù)測(cè)指標(biāo)，篩選出最佳獲益群體。外周血檢測(cè)具有實(shí)時(shí)、無(wú)創(chuàng)、動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)等特點(diǎn)，相信隨著對(duì)腫瘤微環(huán)境研究的深入，檢測(cè)技術(shù)的提高，外周血檢測(cè)可替代組織標(biāo)本或兩者有機(jī)結(jié)合，找到理想的預(yù)測(cè)指標(biāo)，使免疫位點(diǎn)阻斷劑的應(yīng)用更具有針對(duì)性，效果會(huì)更加確切，最終使廣大腫瘤患者受益。