穿心蓮無(wú)菌外植體快繁體系初探

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(貴州農(nóng)業(yè)職業(yè)學(xué)院， 貴陽(yáng) 551400)

穿心蓮(Andrographispaniculate(Burm.f.)Ness)為爵床科穿心蓮屬一年生草本藥用植物，植株高50～100 cm，地上莖為直立四凌形，又名一見喜、攬核蓮、苦草等[1]。因其具有解熱抗炎、增強(qiáng)免疫、抗病毒、抗腫瘤、抗心血管疾病等作用而被廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥領(lǐng)域的研究[2]。 在傳統(tǒng)的育種方法中穿心蓮是以種子播種繁殖為主，由于穿心蓮種子皮厚且硬，其發(fā)芽受到極大的影響，難以滿足工廠化大量育苗的需求[3]。采用組培快繁技術(shù)在短期內(nèi)培育出大量整齊一致的試管苗，加快穿心蓮的繁殖速度，不僅確保具有優(yōu)良性狀的穿心蓮得到保種，更有利于穿心蓮在醫(yī)學(xué)和藥學(xué)等領(lǐng)域的應(yīng)用。然而在實(shí)踐生產(chǎn)中穿心蓮的組織培養(yǎng)依然存在限制其大規(guī)模推廣的問(wèn)題，主要包括材料污染現(xiàn)象、褐化現(xiàn)象以及試管苗玻璃化等[4]，使其產(chǎn)量和品質(zhì)在一定程度上受到較大影響。因此，建立一套較為成熟的穿心蓮的離體快繁技術(shù)，對(duì)促進(jìn)種苗的工廠化生產(chǎn)與應(yīng)用具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 材 料

本實(shí)驗(yàn)以穿心蓮為材料，由貴州農(nóng)業(yè)職業(yè)學(xué)院提供。MS培養(yǎng)基購(gòu)置于上海博微生物科技有限公司，以MS為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，生長(zhǎng)激素為6-BA和NAA。

1.2 方 法

取新鮮的穿心蓮幼葉、腋芽、帶腋芽莖段和不帶腋芽莖段為外植體材料，先用自來(lái)水清洗材料表面的灰塵，再用洗滌劑對(duì)材料進(jìn)行刷洗，放置于自流水沖洗2 h將材料表面洗滌劑除盡，將其分別裝入無(wú)菌瓶中。隨后在超凈工作臺(tái)上用70%乙醇浸泡10 s，無(wú)菌水沖洗干凈，將外植體材料放置于盛有1% HgCl2的培養(yǎng)皿中，分別進(jìn)行2，4，6，8 min的消毒，無(wú)菌水沖洗6次。最后，將處理好的外植體材料分別接種在不同處理的MS瓊脂培養(yǎng)基中，設(shè)置溫度為25 ℃，光強(qiáng)為2 000 lx的環(huán)境下進(jìn)行培養(yǎng)，28 d后統(tǒng)計(jì)污染率。運(yùn)用L16(43)正交表進(jìn)行試驗(yàn)(見表1)，用Microsoft Excel 2007及SPSS 20.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理與分析。

表1 正交試驗(yàn)L16(43)設(shè)計(jì)

水平因素A:外植體B:消毒時(shí)間(min)C:培養(yǎng)基配比(mg/L)1葉片2MS+1.0mg/L6-BA+1.0mg/LNAA2腋芽4MS+1.5mg/L6-BA+1.0mg/LNAA3莖段6MS+1.0mg/L6-BA+1.5mg/LNAA4帶腋芽莖段8MS+1.5mg/L6-BA+1.5mg/LNAA

2 結(jié)果與分析

通過(guò)正交設(shè)計(jì)方法對(duì)穿心蓮?fù)庵搀w進(jìn)行無(wú)菌培養(yǎng)，研究發(fā)現(xiàn)在所有處理中最低污染率為3.33%，而最高污染率達(dá)66.67%(見表2)。

表2 正交設(shè)計(jì)L16(43)實(shí)驗(yàn)結(jié)果

處理外植體數(shù)(個(gè))污染數(shù)(個(gè))污染率(%)1 A1B1C1301860.002 A1B2C2301033.333 A1B3C330516.674 A1B4C430620.005 A2B1C2302066.676 A2B2C1301136.677 A2B3C430413.338 A2B4C330516.679 A3B1C3301550.0010 A3B2C430930.0011 A3B3C130516.6712 A3B4C230620.0013 A4B1C4301653.3314 A4B2C330826.6715 A4B3C23013.3316 A4B4C130310.00

注：其中穿心蓮污染率計(jì)算公式為：污染率(%)=污染數(shù)/處理總數(shù)×100%。

2.1 各因素直觀分析

極差(R)的大小是分析因素對(duì)試驗(yàn)結(jié)果影響程度的重要依據(jù)，極差越大說(shuō)明該因素對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果影響越強(qiáng)，反之，極差越小該因素對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果影響越弱。由表3可知，參試三因素對(duì)穿心蓮無(wú)菌外植體影響的主次關(guān)系是B>A>C，說(shuō)明消毒時(shí)間對(duì)穿心蓮無(wú)菌外植體的影響最大，其次是外植體種類，影響最小是培養(yǎng)基的類型。另外，平均值(Ki)的大小可作為挑選最優(yōu)組合的依據(jù)。分析可知，獲得穿心蓮無(wú)菌外植體的最優(yōu)水平組合為：A4B3C3。

表3 3個(gè)因素對(duì)穿心蓮污染率的直觀分析

水平因素A:外植體B:消毒時(shí)間(min)C:培養(yǎng)基配比(mg/L)K1j9.7517.259.25K2j10.009.509.25K3j8.753.758.25K4j7.005.008.75R3.0013.501.00

2.2 各因素方差分析

利用SPSS 20軟件進(jìn)行方差分析，從表4可知，4種外植體之間p=0.22>0.05，4種消毒時(shí)間p=0.63>0.05，4種培養(yǎng)基間p=0.49>0.05，表明3個(gè)因素對(duì)穿心蓮污染率的影響都不顯著。

綜上分析可知，為了迅速高效地獲得穿心蓮無(wú)菌外植體，應(yīng)選用A4(帶腋芽莖段)為試材，消毒時(shí)間B3為6 min最佳，培養(yǎng)基C3為最佳。所以，A、B和C三因素的最佳水平組合為：A4B3C3，即最佳外植體為帶腋芽莖段，HgCl2消毒最佳時(shí)間為6 min，愈傷組織誘導(dǎo)的最佳培養(yǎng)基為MS+1.0 mg/L 6-BA+1.5 mg/L NAA。

表4 3個(gè)因素對(duì)穿心蓮污染率的直觀分析

變異來(lái)源平方和自由度均方FpA:外植體22.2537.420.140.22B:消毒時(shí)間447.253149.082.840.63C:培養(yǎng)基配比2.7530.920.020.49誤差472.25952.47

3 討 論

在植物組織培養(yǎng)中，外植體接種是組培的前提條件[5]。然而外植體能否接種成功，外植體的選取、消毒時(shí)間以及培養(yǎng)基組成至關(guān)重要[6]。本試驗(yàn)通過(guò)研究不同外植體、HgCl2消毒處理時(shí)間以及不同培養(yǎng)基組成對(duì)穿心蓮愈傷組織誘導(dǎo)及植株再生的影響，發(fā)現(xiàn)經(jīng)0.1%的HgCl2消毒處理不同外植體時(shí)，最適宜的消毒時(shí)間不同。消毒時(shí)間對(duì)獲得穿心蓮無(wú)菌外植體的影響最大，其次是外植體種類，影響最小是培養(yǎng)基的類型。在穿心蓮組培中，應(yīng)當(dāng)首選帶腋芽莖段為外植體建立無(wú)性系，消毒時(shí)間為6 min，培養(yǎng)基MS+1.0 mg/L 6-BA+1.5 mg/L NAA為最佳培養(yǎng)基，最佳組合為A4B3C3。

本研究初步確立穿心蓮無(wú)菌苗體系的關(guān)鍵因素，并建立無(wú)菌苗體系的最佳條件，并獲得了穿心蓮愈傷組織和側(cè)芽的大量無(wú)菌外植體，為穿心蓮無(wú)性系建立及基因轉(zhuǎn)化奠定了基礎(chǔ)。