甲基納曲酮對肝癌HepG2的VEGF的mRNA表達(dá)的抑制作用

伍天影 阮林

【摘要】目的：觀察甲基納曲酮對肝癌HepG2細(xì)胞VEGF的mRNA的影響。方法：分別將含0.01μmol甲基納曲酮（低劑量組）、0.05μmol（中劑量組）、0.1μmol（高劑量組）培養(yǎng)基與肝癌HepG2細(xì)胞共孵72h，以等體積生理鹽水處理組設(shè)立空白對照組。應(yīng)用RT-βCR檢測肝癌HepG2細(xì)胞中VEGF基因表達(dá)水平。結(jié)果：RT-βCR顯示，甲基納曲酮高劑量處理組作用72h的胞VEGF在mRNA水平表達(dá)均較對照組下調(diào)，低濃度組、中濃度組、高濃度組分別為0.75±0.03，0.58±0.05，0.47±0.04，各組均與對照組相比具有顯著性差異（F=107.9，p=0.000），且具有時間依賴關(guān)系。結(jié)論：甲基納曲酮能夠下調(diào)肝癌HepG2細(xì)胞VEGF在mRNA的表達(dá)。

【關(guān)鍵詞】肝癌；甲基納曲酮；mRNA；血管內(nèi)皮生長因子

肝癌是全球第五大癌癥，其死亡率排世界第二m在肝癌的分型中，原發(fā)性肝細(xì)胞癌（Hepatocellular carcinoma HCC）占據(jù)了90%以上，因其高發(fā)率和異質(zhì)性引起廣泛關(guān)注Iz]在癌癥患者自覺癥狀中，癌性疼痛是癌癥患者常出現(xiàn)的主要癥狀之一，晚期癌癥患者中有70%～90%者伴有不同程度癌痛，其中中度疼痛占50%，重度疼痛占30%[3]。甲基納曲酮（MNTX）是首個用于瀉藥治療OIC無效時用于臨床的阿片類藥物拮抗劑。而本篇著重探討甲基納曲酮肝癌HepG2細(xì)胞VEGF的mRNA的影響，對肝癌患者的治療及疼痛管理將有所參考。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

人肝癌細(xì)胞株HepG2由廣西醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院中心實(shí)驗(yàn)室提供。血清購于gibco公司。DMEM培養(yǎng)基購自gibco公司。逆轉(zhuǎn)錄試劑盒及熒光定量PCR試劑盒購自Toyobo公司。TRIzol Reagent購自Invitrogen公司（美國）；PCR primer廣州艾基生物合成，并PAGE純化。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)

HepG2人肝癌細(xì)胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清DMEM培養(yǎng)液中，在37℃、5%CO2、飽和濕度條件下培養(yǎng)、傳代。

1.2.2 熒光定量

PCR檢測VEGF mRNA表達(dá)水平。以0.01μmol甲基納曲酮、0.05μmol甲基納曲酮、0.1gmol甲基納曲酮作用于肝癌HepG2細(xì)胞，同時以等體積生理鹽水處理組為空白對照組。各組分別培養(yǎng)72h后，以Trizol法提取細(xì)胞總RNA，測RNA含量、濃度。按逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書進(jìn)行操作，獲得cDNA。熒光定量PCR用SYBRGreen染料為熒光檢測信號，熒光實(shí)時定量聚合酶鏈反應(yīng)（Real-time quantitativepolymerase chain reaction，RT-qPCR）在八聯(lián)管中反應(yīng)，每組每個基因設(shè)3個復(fù)孔。RT-qPCR引物見表to反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性2min，95℃變性15s，60℃退火并延伸30s，共40個循環(huán)。數(shù)據(jù)采用2-△△Ct法進(jìn)行分析。每次實(shí)驗(yàn)設(shè)3個副孔，重復(fù)3次。

2 結(jié)果

2.1 肝癌HepG2細(xì)胞VEGF的檢測結(jié)果

作用72h后肝癌HepG2細(xì)胞的VEGF在mRNA水平表達(dá)低濃度組、中濃度組、高濃度組相對表達(dá)量分別為0.75±0.03、0.58±0.05、0.47±0.04。各組均與對照組相比具有顯著性差異（F=107.9，p=0.000），且具有時間依賴關(guān)系。

3 討論

癌癥所致的疼痛極大地降低了癌癥患者的生存質(zhì)量。因此疼痛需要規(guī)范的治療[4]。阿片類藥物導(dǎo)致的胃腸道功能障礙主要由于μ阿片受體作用于胃腸道導(dǎo)致，最常用的減輕阿片類藥物性便秘的是使用通便的瀉藥，但使用不當(dāng)時很可能無效[5]。阿片類受體拮抗劑作為治療OIC的藥物的發(fā)展。這些阿片受體拮抗藥物可以特異性結(jié)合μ阿片受體的外周阿片受體，從而有效地制約了胃腸道外周作用。甲基納曲酮在臨床上是一種廣泛使用的阿片類受體拮抗藥，常用于使用阿片類藥物治療癌痛和術(shù)后鎮(zhèn)痛導(dǎo)致的便秘并且不影響其中樞鎮(zhèn)痛作用。有研究表明甲基納曲酮對于前列腺癌具有一定的抑制作用，其在肝癌中的作用還未見報道。

VEGF是一種肝素結(jié)合內(nèi)皮細(xì)胞生長因子，對血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子特定體內(nèi)能誘導(dǎo)血管生成[6]有研究表明相比較于肝癌患者的VEGF（-）/（+）群體，VEGF（++）/（+++）群體在有遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，血管侵犯，AFP>400ng/m占據(jù)的比例顯著更大，且VEGF的過表達(dá)與患者的轉(zhuǎn)移，血管侵犯，生存率有關(guān)[7]。熒光定量PCR檢測，作用72h后肝癌HepG2細(xì)胞的VEGF在mRNA水平表達(dá)低濃度組、中濃度組、高濃度組分別為0.75±0.03、0.58±0.05、0.47±0.04，各組均與對照組相比具有顯著性差異（F=107.9，p=0.000），且具有時間依賴關(guān)系。甲基納曲酮可以下調(diào)HepG2人肝癌細(xì)胞的VEGF在mRNA水平上的表達(dá)。本研究為臨床上在治療肝癌患者時應(yīng)用甲基納曲酮提示了方向。

（通訊作者：阮林）

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