免疫固定電泳在骨髓瘤腎病診斷中的臨床應(yīng)用研究

楊敏，鄭緒香，劉明全，錢晗，周曉萍，許穎

(1.成都醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院檢驗(yàn)科；2.成都醫(yī)學(xué)院醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)系2012級(jí)，四川 成都 610500)

多發(fā)性骨髓瘤(multiple myeloma，MM)是漿細(xì)胞惡性增殖性疾病。骨髓中克隆性漿細(xì)胞異常增生，并分泌單克隆免疫球蛋白或其片段(M蛋白)，導(dǎo)致相應(yīng)的器官和組織損傷。其臨床表現(xiàn)多種多樣[1]，主要臨床表現(xiàn)為貧血、腎功能不全、骨痛、感染和高鈣血癥等。而多發(fā)性骨髓瘤腎損害是多發(fā)性骨髓瘤最常見和嚴(yán)重的并發(fā)癥之一，初診時(shí)有50%～60%的患者存在腎損害，骨髓瘤腎病占本病腫瘤發(fā)病的1%～2%，血液系統(tǒng)腫瘤的10%[2]，且誤診率高。因此如果能盡早發(fā)現(xiàn)和確診骨髓瘤腎病，將有利于疾病的治療。該研究對(duì)62例已確診為骨髓瘤腎病患者分別采用免疫固定電泳技術(shù)對(duì)骨髓瘤分型，免疫比濁法定量檢測(cè)免疫球蛋白、雙縮脲方法檢測(cè)血清總蛋白，探討3種檢測(cè)在骨髓瘤腎病診斷中的作用。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選擇62例2014年1月至2017年2月在本院就診的骨髓瘤腎病住院患者，對(duì)其臨床資料與檢測(cè)標(biāo)本進(jìn)行回顧性分析。62例骨髓瘤腎病患者均符合國(guó)內(nèi)骨髓瘤腎病診斷標(biāo)準(zhǔn)。其中男性41例，女性21例，年齡42～87歲，平均(69.69±10.71)歲。分別進(jìn)行免疫固定電泳、免疫球蛋白和輕鏈定量、血清總蛋白檢測(cè)。同時(shí)，選取30名健康體檢人員作為對(duì)照組。其中男性20例，女性10例，年齡45～83歲，平均年齡(67.91±9.42)歲。

1.2 診斷標(biāo)準(zhǔn)

多發(fā)性骨髓瘤診斷標(biāo)準(zhǔn)符合張之南[3]主編的第三版《血液病診斷及療效標(biāo)準(zhǔn)》中的診斷標(biāo)準(zhǔn)。主要診斷標(biāo)準(zhǔn)：組織學(xué)活檢提示漿細(xì)胞瘤，骨髓漿細(xì)胞增多>30%，過量M蛋白存在；次要診斷標(biāo)準(zhǔn)：骨髓漿細(xì)胞瘤增多10%～30%，M蛋白存在，但未達(dá)到主要標(biāo)準(zhǔn)的規(guī)定，溶骨性病變，血清中正常免疫球蛋白減少。骨髓瘤腎病診斷至少符合1個(gè)主要標(biāo)準(zhǔn)，或3個(gè)次要標(biāo)準(zhǔn)。此外加上持續(xù)蛋白尿、管型尿或腎功能衰竭，除外其他原因?qū)е碌哪I損傷[4]。

1.3 納入標(biāo)準(zhǔn)和排除標(biāo)準(zhǔn)

1.3.1 納入標(biāo)準(zhǔn) (1)患者簽署知情同意書，了解此次研究用途和目的，并同意配合此次研究的患者；(2)符合國(guó)內(nèi)骨髓瘤腎病診斷標(biāo)準(zhǔn)，在本院就診，確診的住院患者；(3)尚未經(jīng)藥物治療。

1.3.2 排除標(biāo)準(zhǔn) (1)診斷不明確的患者；(2)已經(jīng)用藥物治療且有明顯好轉(zhuǎn)的患者。

1.4 儀器

免疫球蛋白及輕鏈定量測(cè)定使用美國(guó)Beckman Coulter Immage 800特種蛋白分析儀及該公司生產(chǎn)的校準(zhǔn)液、質(zhì)控品和抗體試劑。免疫固定電泳用美國(guó)Helena公司spife 3000全自動(dòng)瓊脂糖凝膠電泳儀及其配套試劑進(jìn)行測(cè)定。血清總蛋白用日立式7600型全自動(dòng)生化分析儀及配套試劑。

1.5 方法

取早晨空腹靜脈血，離心分離血清，避免溶血和脂血。

1.5.1 免疫固定電泳 其檢測(cè)運(yùn)用了瓊脂糖凝膠電泳法和免疫固定技術(shù)。首先將患者血清按照1∶3(50 μL血清+150 μL生理鹽水)和1∶5(50 μL血清+200 μL生理鹽水)的比例進(jìn)行稀釋；吸入17 μL 1∶3的樣本于SP位置，其于5個(gè)位置加17 μL 1∶5的樣本；樣品梳放好，加入界面液，放好電泳片，避免產(chǎn)生氣泡，吸去多于的緩沖液；按程序開始電泳；然后加入抗血清50 μL，按照說明書繼續(xù)；最后染色，大約30 min后結(jié)束，拿出電泳片進(jìn)行掃描。

1.5.2 血清總蛋白 總蛋白的測(cè)定采用雙縮脲法測(cè)定，其操作按照日立式7600型全自動(dòng)生化分析儀的說明書進(jìn)行。

1.5.3 免疫球蛋白 免疫球蛋白的檢測(cè)采用免疫散射比濁法，用美國(guó)Beckman Coulter Immage 800特種蛋白分析儀及其該公司生產(chǎn)的校準(zhǔn)液、質(zhì)控品和抗體試劑按照其操作說明書進(jìn)行。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 骨髓瘤腎病患者骨髓細(xì)胞形態(tài)學(xué)

正常人骨髓中漿細(xì)胞僅占(0.64±0.69)%[5]。而骨髓瘤腎病患者骨髓中漿細(xì)胞異常增生，原漿和幼漿所占比例增加，且出現(xiàn)雙核的原始漿細(xì)胞，圖中可見紅細(xì)胞成緡錢狀排列，其形態(tài)學(xué)見圖1。

2.2 骨髓瘤腎病血清免疫固定電泳圖結(jié)果的判斷

免疫固定電泳中，由于其采用了瓊脂糖凝膠和抗原抗體特異性結(jié)合的方法，單克隆免疫球蛋白(M蛋白)是一條致密、濃染、狹窄、界限分明的沉淀帶，并且該條帶與SP位置上M條帶處于同1個(gè)位置，界限清楚，正常人及常見的骨髓瘤電泳圖譜類型見圖2。

2.3 免疫固定電泳結(jié)果及分型

在30名健康對(duì)照組中，血清免疫固定電泳結(jié)果均為陰性。在62例患者中，血清免疫固定電泳結(jié)果均為陽(yáng)性，陽(yáng)性檢出率為100%。各種類型的電泳結(jié)果均呈現(xiàn)明顯濃集的條帶，免疫固定電泳分型結(jié)果見表1。在62例骨髓瘤腎病患者血清中，16例(25.81%)為IGGκ，12例(19.35%)為IGGλ，2例(3.23%)為IGMκ，4例(6.45%)為IGMλ，11例(17.74%)為IGAκ，6例(9.68%)為IGAλ，5例(8.06%)為κ，6例(9.68%)為λ。由此可見，骨髓瘤腎病中以IGG型為主，占45.16%。

表1 62例患者血清免疫固定電泳結(jié)果[n(%)]

2.4 免疫球蛋白及輕鏈定量檢測(cè)結(jié)果

在62例患者血清標(biāo)本中，有51例患者球蛋白及其輕鏈顯著增高，陽(yáng)性檢出率為82.25%。檢測(cè)出各個(gè)類型結(jié)果見表2，其中IGG型有24例，IGA型9例，IGM型5例，輕鏈κ型4例，λ型3例。62例各類型骨髓瘤腎病及30例對(duì)照組中免疫球蛋白含量結(jié)果見表3，患者組中各類型骨髓瘤腎病免疫球蛋白含量均高于對(duì)照組中的含量。

表2 62例患者血清免疫球蛋白定量分型結(jié)果(n)

表3 62例患者血清免疫球蛋白定量結(jié)果

*P<0.05，與健康組比較。

2.5 血清總蛋白檢測(cè)結(jié)果

在62例骨髓瘤腎病患者中，有40例血清總蛋白顯著升高，血清總蛋白陽(yáng)性檢出率為64.52%。

2.6 3種檢測(cè)方法的比較

經(jīng)過對(duì)62例患者血清標(biāo)本的結(jié)果分析，比較其陽(yáng)性檢出率，3種方法對(duì)骨髓瘤腎病的檢測(cè)結(jié)果差異，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=26.75，P<0.01)，結(jié)果見表4。

表4 3種檢測(cè)方法對(duì)骨髓瘤腎病患者血清中M蛋白的檢出率[n(%)]

組別例數(shù)血清免疫球蛋白定量免疫固定電泳血清總蛋白IGG骨髓瘤2838.71(24/62)45.16(28/62)IGA骨髓瘤1724.19(15/62)27.42(17/62)IGM骨髓瘤68.06(5/62)9.68(6/62)輕鏈病1111.29(7/62)17.74(11/62)合計(jì)6282.25(51/62)100(62/62) 64.52(40/62)

3 討論

骨髓瘤腎病是MM最常見且最嚴(yán)重的并發(fā)癥之一，其臨床表現(xiàn)可分為腎臟表現(xiàn)和腎外表現(xiàn)。腎臟表現(xiàn)以蛋白尿型、腎病綜合征型等，腎外表現(xiàn)有貧血，出血傾向，如曾報(bào)道有1例患者因皮膚表現(xiàn)為紫癜、淤點(diǎn)就診[6]，此外還有病理性骨折和漿細(xì)胞骨髓外浸潤(rùn)導(dǎo)致的肝、脾淋巴結(jié)腫大[7]，并且骨髓瘤腎病起病較隱匿。因此早期就診和誤診率較高，據(jù)有關(guān)文獻(xiàn)分析其誤診率高達(dá)65.17%[8]。多發(fā)性骨髓瘤自然病程6～12個(gè)月，有效化療后中位生存期3～4年，MM患者腎損害<3個(gè)月腎功能逆轉(zhuǎn)可達(dá)50%～70%，而MM患者腎損害>3個(gè)月腎功能可逆轉(zhuǎn)僅為10%[9]。因此如果能在骨髓瘤腎病早期做出診斷，將有利于疾病的治療和恢復(fù)。目前用于骨髓瘤腎病診斷的檢查方法有骨髓涂片檢查，尿本周蛋白、血沉的測(cè)定以及血清蛋白電泳。該病導(dǎo)致的是局灶性病變，因此骨髓涂片檢查時(shí)骨髓瘤細(xì)胞形態(tài)復(fù)雜，難于辨認(rèn)，且很難1次骨穿就查出骨髓瘤細(xì)胞。而尿本周蛋白和血沉檢測(cè)前者陽(yáng)性率太低，后者特異性較低，可用于篩選實(shí)驗(yàn)，且相關(guān)報(bào)道指出，在尿液中檢測(cè)λ和κ的靈敏度和特異度均比檢測(cè)血液中的免疫球蛋白低[10]。血清蛋白電泳可對(duì)血清中異常蛋白進(jìn)行篩選，并計(jì)算各蛋白百分含量，成為檢測(cè)球蛋白增高的首選方法[11]。但對(duì)骨髓瘤腎病的診斷中，能檢測(cè)出球蛋白增高的類型及含量，將對(duì)臨床診斷和治療有著顯著的臨床意義，因此本次病例分析了62例已確診患者的免疫固定電泳、免疫球蛋白定量及總蛋白的結(jié)果，比較其對(duì)62例確診患者的檢出率。

免疫固定電泳技術(shù)結(jié)合了免疫固定技術(shù)和瓊脂糖凝膠電泳技術(shù)，血清蛋白首先通過電泳進(jìn)行分離，然后可溶性抗原和抗體進(jìn)行結(jié)合反應(yīng)，形成的抗原-抗體復(fù)合物變成不溶性沉淀物，沉淀率取決于反應(yīng)物的比例、溫度、溶液鹽濃度和pH值，通過染色可觀察到免疫沉淀帶，大量研究表明[12-16]，IFE技術(shù)靈敏度和特異度較高，能快速的分離和鑒別出單克隆免疫蛋白，該技術(shù)對(duì)M蛋白的檢出率為5～10 mg/L。本次分析62例已確診患者的標(biāo)本，62例免疫固定電泳均為陽(yáng)性，IFE對(duì)M蛋白的檢出率為100%。在62例骨髓瘤腎病患者血清中，免疫固定電泳可檢測(cè)出其類型，16例(25.81%)為IGGκ，12例(19.35%)為IGGλ，2例(3.23%)為IGMκ，4例(6.45%)為IGMλ，11例(17.74%)為IGAκ，6例(9.68%)為IGAλ，5例(8.06%)為κ，6例(9.68%)為λ。在本組研究中表明骨髓瘤腎病中以IGG型為主，不同類型的骨髓瘤腎病造成的其他臨床表現(xiàn)也不同，如IGG型易引起感染，IGA型易導(dǎo)致高鈣血癥和高膽固醇癥，因此采用IFE技術(shù)對(duì)骨髓瘤腎病進(jìn)行分型，將有利于疾病的治療和臨床癥狀的控制。

與免疫球蛋白定量實(shí)驗(yàn)及血清總蛋白實(shí)驗(yàn)相比，定量實(shí)驗(yàn)是采用抗原抗體結(jié)合的免疫散射比濁法，由于骨髓瘤腎病患者存在免疫系統(tǒng)的損害，因此定量的結(jié)果中可見1種免疫球蛋白增高，其他免疫球蛋白低于正常人群。部分患者的定量結(jié)果仍在正常范圍以內(nèi)，其結(jié)果有假陰性。本組分析的62例確診患者血清中，有51例(82.25%)定量實(shí)驗(yàn)陽(yáng)性，較總蛋白的檢出率較高，但臨床診斷中仍需要結(jié)合免疫固定電泳來具體分析。血清總蛋白結(jié)果中40例(64.52%)結(jié)果顯著增高。但是血清總蛋白的升高主要是反映肝臟合成功能和腎臟造成的蛋白丟失情況，其升高可見于嚴(yán)重嘔吐、腹瀉等血液濃縮造成的及血漿蛋白合成增加等原因，因此其特異性較差。在臨床中如果有老年患者總蛋白和球蛋白明顯增高，白球比例倒置，有慢性腎炎或腎病綜合征的情況應(yīng)建議其做骨髓穿刺、免疫固定電泳等檢查，并懷疑骨髓瘤腎病。

免疫固定電泳、免疫球蛋白定量及血清總蛋白結(jié)果相比，免疫固定電泳的陽(yáng)性檢出率較高，本組分析的62例確診患者血清中，免疫固定電泳結(jié)果中62例(100%)均為陽(yáng)性，有51例(82.25%)定量實(shí)驗(yàn)陽(yáng)性，血清總蛋白40例(64.52%)結(jié)果顯著增高?？梢?，免疫固定電泳對(duì)M蛋白的檢出率高于免疫球蛋白定量和血清總蛋白，通過統(tǒng)計(jì)學(xué)對(duì)3種方法檢測(cè)結(jié)果差異顯著，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，IFE對(duì)骨髓瘤腎病的檢測(cè)率明顯較高。但免疫球蛋白定量技術(shù)能夠精準(zhǔn)的檢測(cè)出血清中M蛋白的含量 ，在各類型的骨髓瘤腎病患者中，免疫球蛋白含量均出現(xiàn)相對(duì)應(yīng)的增高，免疫球蛋白定量可用于已確診的患者的病情分析和療效觀察[17]，免疫固定電泳有利于疾病的初次診斷及篩查。

綜上所述，IFE作為骨髓瘤腎病的常規(guī)檢測(cè)方法之一，其應(yīng)用了抗原抗體的原理和電泳技術(shù)，具有較高的特異度和靈敏度。因此能夠?qū)崿F(xiàn)早期診斷和早期治療的目的，并且對(duì)于患者的診斷、預(yù)后及病情的早期處理有較大的臨床意義。