薄層色譜法與高效液相色譜法對(duì)18F-FDG放射化學(xué)純度測(cè)定的比較研究

雷震山 陳立光 張勤國(guó) 梁明泉 鄧慶榮

正電子發(fā)射斷層顯像(positron emission tomography, PET)是一種先進(jìn)的核醫(yī)學(xué)影像技術(shù), 而計(jì)算機(jī)斷層攝影術(shù)(computed tomography, CT)是一種X線斷層成像技術(shù), 并已在臨床廣泛應(yīng)用。PET/CT是二者的有機(jī)結(jié)合, 是近年發(fā)展起來(lái)的先進(jìn)核醫(yī)學(xué)技術(shù), 有廣闊的應(yīng)用前景。PET/CT通過(guò)影像記錄細(xì)胞增殖的標(biāo)記分子, 從而預(yù)測(cè)腫瘤和心臟、腦部疾病的個(gè)性化治療反應(yīng)［1-3］。18F-FDG是目前臨床上常用的正電子放射性藥物, 可用于腫瘤、心肌存活以及中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病的診斷。18F-FDG大部分由醫(yī)院自行制備, 經(jīng)過(guò)在國(guó)內(nèi)近20年的臨床試用, 2015年版《中國(guó)藥典(二部)》［4］開(kāi)始將其收載為18F-FDG。隨著我國(guó)PET/CT掃描儀普及以及回旋加速器藥物生產(chǎn)系統(tǒng)投入使用,18F-FDG的制備、藥品質(zhì)量控制和用藥安全越來(lái)越受到國(guó)家藥監(jiān)部門的重視。作為正電子類放射性核素標(biāo)記的放射性藥物, 在所用質(zhì)量控制指標(biāo)中18F-FDG的放化純度是最重要的指標(biāo), 其放化純度的高低嚴(yán)重影響著PET/CT掃描的圖像質(zhì)量, 從而影響影像醫(yī)學(xué)專家的診斷?！吨袊?guó)藥典(四部)》［5］明確規(guī)定18F-FDG的放化純度＞90%,檢測(cè)方法參照TLC(通則0502)試驗(yàn)。文獻(xiàn)中常用TLC、HPLC進(jìn)行檢測(cè)［6-10］, 本研究擬探討一種快速準(zhǔn)TLC方法用于檢測(cè)放化純度, 并對(duì)比HPLC、TLC 方法在檢測(cè)18F-FDG放化純度的差異。報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

1.1.1 儀器 Eclipse RD 型Cyclotron 回旋加速器(西門子公司)；藥物生產(chǎn)系統(tǒng)(發(fā)明專利申請(qǐng)?zhí)枺?0171068609.4)；CRC-15R 型活度計(jì)(美國(guó)CAPINTEC公司)；HPLC(Agilent 1200 , Agilent公司, 配備Binary 雙泵, Variable Wavelength檢測(cè)器, 7725i帶傳感器進(jìn)樣器), 分離柱為高效糖柱(High Performance Carbohydrate Column, 60 A, 4 μm)；PET metabolite Dual BGO型流動(dòng)放射性活度檢測(cè)器(Bioscan公司)；MiniGita薄層色層(TLC)儀(Raytest 公司)。

1.1.2 試劑 H218O(豐度95%, ABX公司)；2-三氟甲基磺?；?β-D甘露糖(三氟甘露糖, Sigma-Aldrich公司)；Kryptofix2.2.2(K2.2.2), 無(wú)水乙腈(Sigma-Aldrich公司)；硅膠板(Whatman PE Silg/UV, Whatman公司 )；QMA 柱、Alumin-N 柱、C-18柱(均為Waters公司)；AG50樹(shù)脂和AG11A8樹(shù)脂(50-100目, Bio-Rad公司)。HPLC級(jí)甲醇、乙醇、乙腈(均為德國(guó)Merk公司)；層析紙(英國(guó)Whatman)；硅膠紙(上海造紙研究所)。

1.2 方法

1.2.118F-FDG的合成18F-FDG的制備包括標(biāo)準(zhǔn)的六個(gè)步驟。①首先是18F-負(fù)離子的產(chǎn)生, 從O-18富氧水開(kāi)始, 通過(guò)p-n核反應(yīng)產(chǎn)生18F-負(fù)離子。②俘獲和釋放18F-負(fù)離子。③通過(guò)乙腈和水的共沸原理移除反應(yīng)體系中的水分形成反應(yīng)活性18F-負(fù)離子。④反應(yīng)活性放射性18F-負(fù)離子和2-三氟甲基磺酰基-β-D甘露糖發(fā)生親核反應(yīng), 產(chǎn)生18F-負(fù)離子輻射標(biāo)記的甘露糖三氟磺酸酯。⑤水解移除乙酰基保護(hù)基團(tuán)。⑥純化產(chǎn)物, 這一步移除各種中間產(chǎn)物并作無(wú)菌、無(wú)熱源等純化處理。

1.2.218F-FDG產(chǎn)品的TLC分析 按照《中國(guó)藥典(二部)》2015版方法進(jìn)行。取Whatman PE Silg/UV硅膠板(200 mm×200 mm)裁成高100 mm、寬10 mm, 并用鉛筆在一側(cè)輕輕畫(huà)上距離底端距離為10 mm 的記號(hào)線, 在記號(hào)線的中央做標(biāo)識(shí)作為點(diǎn)樣標(biāo)識(shí)點(diǎn)；以乙腈-水(95∶5)為展開(kāi)劑展開(kāi), 將晾干后的硅膠G板放置于MiniGita薄層色譜儀中, 將點(diǎn)樣標(biāo)識(shí)點(diǎn)所在的刻度線和薄層色譜儀的0刻度線重合。啟動(dòng)MiniGita TLC軟件對(duì)硅膠G板的放射性分布進(jìn)行檢測(cè), 掃描時(shí)間為10 min, 能量范圍：450～750 keV；采用GINA軟件分析圖譜的Rf值和峰面積, 軟件自動(dòng)計(jì)算出18F-FDG放化純度。

1.2.318F-FDG產(chǎn)品的HPLC分析 HPLC選擇高效糖柱作為分離柱；流動(dòng)相為V(乙腈)：V(水)=85∶15, 手動(dòng)調(diào)節(jié)流動(dòng)相流速為1.0 ml/min, 分析時(shí)間設(shè)定為15 min。分析時(shí)使用WINFLOW軟件, 設(shè)置啟動(dòng)方式為“外部手動(dòng)”；測(cè)量樣品池體積為30 μl；選擇核素能峰為511 keV；開(kāi)啟一個(gè)高能放射性測(cè)量通道及一個(gè)非放射性測(cè)量通道, 顯示屏?xí)瑫r(shí)出現(xiàn)兩個(gè)侯命的測(cè)量坐標(biāo)系。進(jìn)樣后扳動(dòng)進(jìn)樣閥。兩個(gè)測(cè)量系統(tǒng)開(kāi)始工作, 分別采集經(jīng)過(guò)高效糖柱分離后放射性及非放射性信號(hào), 顯示屏上同時(shí)觀察兩個(gè)峰譜。

2 結(jié)果

2.1 TLC分析18F-FDG產(chǎn)品的放化純度 TLC的支持體為硅膠G薄層板, 以乙腈-水(95∶5)為展開(kāi)劑, 展開(kāi)完畢后用TLC掃描, 測(cè)定放射性分布,18F-FDG的Rf=0.435, 符合2015版藥典標(biāo)準(zhǔn)0.4～0.6的范圍, 測(cè)得其放化純度為99.82%,符合2015版藥典規(guī)定放化純度≥90%的標(biāo)準(zhǔn)。見(jiàn)圖1。

圖1 18F-FDG的TLC分析圖

2.2 HPLC法測(cè)定18F-FDG放化純度

2.2.1 乙睛濃度和流速對(duì)18F與18F-FDG保留時(shí)間的影響手動(dòng)設(shè)定流動(dòng)相流速為1.0 ml/min, 改變流動(dòng)相的濃度, 對(duì)18F與18F-FDG在分離柱的保留時(shí)間進(jìn)行分析, 確定50%和85%的乙腈能有效分離組份。因50%的乙腈濃度在分離柱上的阻力較大, 故選擇85%的乙腈作為流動(dòng)相, 用85%乙腈作流動(dòng)相時(shí)18F-FDG的放化純度分析時(shí)間在15 min左右。通過(guò)增加流速進(jìn)行對(duì)比分析, 隨著流動(dòng)相的加快,18F與18F-FDG的保留時(shí)間均減少, 均能有效地分離組分。

2.2.2 HPLC對(duì)18F-FDG放化純度的分析 流動(dòng)相為85%的乙睛, 流速為1 ml/min。tR=6.6 min處有一放射性峰, 為游離的18F。見(jiàn)圖2。18F與18F-FDG混合后的HPLC譜上有2個(gè)放射性峰, 第1個(gè)為游離的18F, tR=6.5 min, 第2個(gè)峰為產(chǎn)品18F-FDG, tR=9.2 min。用計(jì)算機(jī)自動(dòng)積分計(jì)算,18F-FDG的放化純度＞98%,18F放射性峰與單獨(dú)進(jìn)樣的18F的保留時(shí)間微少的區(qū)別。見(jiàn)圖3。其原因可能是進(jìn)樣樣品中不同組份的存在, 影響了化合物在柱子上的分離系數(shù), 從而影響了保留時(shí)間。在經(jīng)過(guò)多批次的檢測(cè)試驗(yàn)表明, 用HPLC方法分析18F-FDG放化純度批間穩(wěn)定性良好,18F與18F-FDG的保留時(shí)間不變。

圖2 18F的HPLC分析圖

3 小結(jié)

①采用硅膠G薄層板作為TLC的支持體, 以乙腈-水(95∶5)為展開(kāi)劑, TLC可有效測(cè)定18F-FDG的放化純度。18F-FDG的Rf=0.435, 符合2015版藥典標(biāo)準(zhǔn)0.4～0.6的范圍,測(cè)得其放化純度為99.82%, 符合2015版藥典規(guī)定放化純度≥90%的標(biāo)準(zhǔn)。②采用V(乙腈)：V(水)=85∶15作為HPLC流動(dòng)相, 高效糖柱為分離柱, 流速為1.0 ml/min, HPLC可有效測(cè)定18F-FDG放射化學(xué)純度, 測(cè)得其放化純度＞98%, 符合2015版藥典規(guī)定放化純度≥90%的標(biāo)準(zhǔn)。時(shí)間約15 min左右。

總之, TLC和HPLC兩種方法都能有效的測(cè)定18F-FDG的放化純度, 而TLC 法方法簡(jiǎn)便, 適用于常規(guī)檢驗(yàn)。

圖3 18F與18F-FDG的HPLC分析圖