觀察非小細(xì)胞肺癌患者循環(huán)腫瘤細(xì)胞在治療中的動(dòng)態(tài)變化及與預(yù)后相關(guān)性的前瞻性研究

黃韻堅(jiān)　徐海鵬　黃誠(chéng)

【摘要】 目的：探究非小細(xì)胞肺癌患者循環(huán)腫瘤細(xì)胞在治療中的動(dòng)態(tài)變化及相關(guān)的預(yù)后前瞻性研究。方法：選取本院2014年1月-2017年1月收治的200例晚期非小細(xì)胞肺癌患者，在給予治療后，采集患者一線、二線化療前后外周血，采用多重mRNA原位分析法測(cè)定患者治療前后循環(huán)腫瘤細(xì)胞（CTC）計(jì)數(shù)，采用相關(guān)性分析軟件對(duì)CTC細(xì)胞數(shù)變化與無(wú)進(jìn)展生存期（progression-free survival，PFS）、客觀緩解率（objective response rate，ORR）、總生存期（overall survival，OS）的關(guān)系進(jìn)行分析。結(jié)果：200例患者治療后CTC細(xì)胞陽(yáng)性率顯著低于治療前，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；同時(shí)，患者的CTC表達(dá)同OS與ORR均呈負(fù)相關(guān)（P<0.05）。結(jié)論：非小細(xì)胞肺癌患者采用一線、二線化療時(shí)通過(guò)捕捉檢測(cè)患者外周血中痕量存在的CTC，采用多重mRNA原位分析法動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)CTC細(xì)胞數(shù)，有助于評(píng)估臨床療效，且與預(yù)后具有相關(guān)性，有助于指導(dǎo)臨床治療，可進(jìn)一步分析研究。

【關(guān)鍵詞】 非小細(xì)胞肺癌； 循環(huán)腫瘤細(xì)胞； 動(dòng)態(tài)分析； 相關(guān)性

A Prospective Study on the Dynamic Changes in the Treatment of Circulating Tumor Cells in Patients with Non-small Cell Lung Cancer and the Correlation with Prognosis/HUANG Yunjian，XU Haipeng，HUANG Cheng，et al.//Medical Innovation of China，2018，15（14）：037-040

【Abstract】 Objective：To investigate the dynamic changes of circulating tumor cells in patients with non-small cell lung cancer （NSCLC） and to investigate the prognosis of the changes.Method：200 patients with advanced non-small cell lung cancer treated in our hospital from January 2014 to January 2017 were selected.Blood samples were collected before and after the first and second chemotherapy.Determination of circulating tumor cells （CTC） count before and after treatment by multiple mRNA in situ analysis，and correlation analysis software was used to analyze the relationship between CTC cell number and progression-free survival（PFS），objective response rate（ORR），overall survival（OS）.Result：The positive rate of CTC cells in 200 patients after treatment was significantly lower than that before treatment（P<0.05）.Meanwhile，the expression of CTC was negatively correlated with OS and ORR（P<0.05）.Conclusion：Patients with non-small cell lung cancer use the first line and second line chemotherapy to detect the presence of trace CTC in the peripheral blood of the patients，the multiple mRNA in situ analysis is used to dynamically monitor the number of CTC cells，it is helpful to evaluate the clinical effect and be related to the prognosis，which helps to guide the clinical treatment and can be further analyzed.

【Key words】 Nonsmall-cell lung cancer； Circulating tumor cells； Dynamic analysis； Correlation

First-authors address：Fujian Province Tumor Hospital Affiliated to Fujian Medical University，F(xiàn)uzhou 350014，China

doi：10.3969/j.issn.1674-4985.2018.14.009

肺癌是一種臨床上常見(jiàn)的惡性腫瘤，近年來(lái)隨著各種環(huán)境因素以及我國(guó)人均壽命的延長(zhǎng)，我國(guó)肺癌發(fā)生率也隨之上升。其中非小細(xì)胞肺癌（NSCLC）占到了肺癌患者的85%左右[1]，并且大多數(shù)處于晚期，目前晚期非小細(xì)胞肺癌患者死亡率處于我國(guó)惡性腫瘤首位，在治療上，傳統(tǒng)的治療方式主要是化療[2]，目前隨著分子生物技術(shù)及藥物的發(fā)展，出現(xiàn)了靶向治療與免疫治療，使晚期肺癌患者的生存期明顯延長(zhǎng)，在肺癌治療中，一般采用影像學(xué)進(jìn)行評(píng)價(jià)，但存在滯后性，并且無(wú)法進(jìn)行生物學(xué)特點(diǎn)的檢測(cè)。循環(huán)腫瘤細(xì)胞（CTC）泛指存在于人體外周血內(nèi)各類(lèi)腫瘤細(xì)胞的總稱(chēng)，此類(lèi)細(xì)胞多由于自發(fā)性或診療性操作使其在原有實(shí)體病灶中脫落，而后進(jìn)入人體外周血中，多數(shù)自行凋亡，僅少數(shù)進(jìn)展為轉(zhuǎn)移灶，對(duì)患者生命安全存在嚴(yán)重威脅。CTC能夠準(zhǔn)確反映患者的腫瘤基因信息，通過(guò)監(jiān)測(cè)患者的CTC類(lèi)型與數(shù)量可了解其腫瘤病灶動(dòng)態(tài)變化情況，并且有助于評(píng)估治療效果，輔助開(kāi)展個(gè)體性治療方案。同時(shí)，臨床檢測(cè)CTC具有良好的簡(jiǎn)便性，并且能夠持續(xù)進(jìn)行動(dòng)態(tài)檢測(cè)，從而實(shí)時(shí)給予反饋輔助醫(yī)師及時(shí)給予治療策略改變，更有助于提升臨床治療效果，延長(zhǎng)患者生存時(shí)間。既往研究發(fā)現(xiàn)，將CTC用于肺癌患者治療評(píng)估中效果理想，有助于評(píng)估患者預(yù)后并指導(dǎo)臨床治療，但不同的研究采用不同的方法界定CTC，且樣本量偏少。本次研究本院主要對(duì)NSCLC患者治療中循環(huán)腫瘤細(xì)胞動(dòng)態(tài)變化做了記錄分析，同時(shí)探討了CTC同無(wú)進(jìn)展生存期（progression-free survival，PFS）、客觀緩解率（objective response rate，ORR）、總生存期（overall survival，OS）的關(guān)系，具體報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 將本院2014年1月-2017年1月收治的200例晚期非小細(xì)胞肺癌患者作為研究對(duì)象。納入標(biāo)準(zhǔn)：所有患者經(jīng)檢查均確診為晚期非小細(xì)胞肺癌患者；年齡均≥18歲[3]。排除標(biāo)準(zhǔn)：妊娠或處于哺乳期的患者；研究期間不采取避孕措施的育齡患者；可通過(guò)血液等方式傳播免疫缺陷病毒的患者[4]。其中男126例，女74例，年齡39～82歲，平均（62.8±10.2）歲；120例患者有吸煙史，80例患者無(wú)吸煙史；TNM分期：ⅢB期62例，Ⅳ期138例；病理類(lèi)型：腺癌110例，鱗癌90例；ECOG評(píng)分：0分128例，1分72例；遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移數(shù)目：62例無(wú)轉(zhuǎn)移，60例有1處轉(zhuǎn)移，28例有2處轉(zhuǎn)移，50例有2處以上轉(zhuǎn)移。本研究已經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)通過(guò)，所有患者均簽署了本研究的知情同意書(shū)。

1.2 方法

1.2.1 治療方法 所有患者治療前均進(jìn)行心電圖、血常規(guī)、腫瘤標(biāo)志物及胸腹CT等檢查[5]。根據(jù)患者病情醫(yī)生選擇藥物化療?；煼桨笧椋阂痪€化療使用順鉑或卡鉑聯(lián)合紫杉醇、培美曲塞、吉西他濱和多西紫杉醇進(jìn)行；二線化療使用多西紫杉醇或培美曲塞單種藥物進(jìn)行[6-7]。以上化療均3周為1個(gè)周期，需化療4～6個(gè)周期，并給予隨訪。

1.2.2 檢測(cè)方法 樣本采集：采集一線/二線化療前后外周血，化療前3 d進(jìn)行第一次血液采集，且將其定為基線，第二周期化療前3 d進(jìn)行第二次采集，第三周期化療前3 d進(jìn)行第三次采集，若化療過(guò)程中進(jìn)展，則進(jìn)行采血（第四次）；入組后6個(gè)月未見(jiàn)進(jìn)展則終止采血[8]。CTC檢測(cè)：應(yīng)用廣州益善生物醫(yī)藥科技公司開(kāi)發(fā)的CanPatrolTM方法（多重mRNA原位分析法），采用人外周血非血源細(xì)胞分型檢測(cè)試劑盒（多重mRNA原位分析法）開(kāi)展CTC檢測(cè)。首先，提取患者外周血5 mL，對(duì)標(biāo)本進(jìn)行裂解紅細(xì)胞，再由納米過(guò)濾技術(shù)截留CTC，通過(guò)多重RNA原位分析與掃描獲得最終檢測(cè)結(jié)果[9-10]。檢測(cè)所應(yīng)用核酸探針及其序列，見(jiàn)表1。檢驗(yàn)后由2名檢驗(yàn)醫(yī)師評(píng)定CTC計(jì)數(shù)，其中陽(yáng)性表示CTC計(jì)數(shù)>2，陰性表示CTC計(jì)數(shù)等于1。

1.3 觀察指標(biāo) （1）CTC細(xì)胞數(shù)量：測(cè)量并記錄肺癌患者治療前后的CTC細(xì)胞數(shù)量（CTC計(jì)數(shù)由廣州益善生物醫(yī)藥科技有限公司所研發(fā)的診斷系統(tǒng)進(jìn)行記錄）[11]。（2）相關(guān)性分析：分析治療前后CTC計(jì)數(shù)變化及其與PFS、ORR、OS的關(guān)系。CTC與PFS、ORR、OS的相關(guān)性采用Spearmans rank系數(shù)分析[12-13]。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 數(shù)據(jù)應(yīng)用SPSS 18.0進(jìn)行分析，計(jì)量資料用（x±s）表示，比較采用t檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料以率（%）表示，比較采用字2檢驗(yàn)，相關(guān)性分析應(yīng)用Spearmans rank系數(shù)，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 200例患者治療前后的CTC陽(yáng)性率比較 200例患者治療后CTC細(xì)胞陽(yáng)性率為42.5%（85/200），明顯低于治療前的71.0%（142/200），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（字2=6.463，P<0.05）。

2.2 患者CTC和ORR、OS的相關(guān)性分析 由Spearmans rank系數(shù)對(duì)比，患者CTC與PFS、ORR及OS均存在負(fù)相關(guān)（P<0.05），見(jiàn)表2。隨著總生存率的不斷降低，CTC陰性率和陽(yáng)性率均呈現(xiàn)降低趨勢(shì)，見(jiàn)圖1。隨著客觀緩解率的升高，CTC陰性率和陽(yáng)性率均呈現(xiàn)升高趨勢(shì)，見(jiàn)圖2。

3 討論

本次研究通過(guò)對(duì)200例非小細(xì)胞肺癌患者開(kāi)展CTC檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，治療前CTC陽(yáng)性共142例，陽(yáng)性率為71.0%；治療后CTC陽(yáng)性85例，陽(yáng)性率為42.5%，治療后CTC陽(yáng)性率明顯降低，表現(xiàn)其化療方案有助于抑制CTC表達(dá)，而CTC表達(dá)情況也能對(duì)臨床治療起到輔助作用。同時(shí)，本研究結(jié)果顯示，患者的CTC表達(dá)同期PFS、ORR與OS存在密切相關(guān)性，CTC陽(yáng)性患者的OS明顯短于陰性患者，并且CTC陽(yáng)性患者的ORR明顯低于陰性患者，表現(xiàn)出CTC表達(dá)對(duì)患者的預(yù)后情況有良好預(yù)估效果。Mokhles等[14]主要分析了Ⅲ期和Ⅳ期患者一個(gè)周期化療前后的CTCs數(shù)據(jù)，得出肺癌分期和CTCs之間存在一定關(guān)系，Ⅳ期患者檢測(cè)出的CTCs明顯多于Ⅲ期患者；另外，經(jīng)多因素分析表明CTCs與PFS、OS和ORR存在一定相關(guān)性[15-17]。陳昌南等[15]研究結(jié)果中也表明了CTCs的數(shù)量變化與CT檢查結(jié)果相同，提示可根據(jù)CTCs數(shù)量變化進(jìn)行病情診斷。以上研究均與本研究結(jié)果一致。CTCs的研究依賴(lài)于CTC-Chip技術(shù)，其原理主要是將腫瘤細(xì)胞的EpCAM作為靶抗原，從而設(shè)計(jì)相對(duì)應(yīng)的抗體，達(dá)到捕獲CTC的目的[16-17]。而腫瘤細(xì)胞在其生長(zhǎng)發(fā)展過(guò)程中會(huì)發(fā)生上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT），所以CTC-Chip在捕獲CTC過(guò)程中出現(xiàn)遺漏，從而降低結(jié)果的準(zhǔn)確性，另外有大量研究表明，CTC-Chip技術(shù)捕獲效率較低，對(duì)非小細(xì)胞肺癌的捕獲率僅25%左右[18-19]。為了避免上皮標(biāo)志物鑒別法帶來(lái)的局限性，因此，本次研究筆者采用的是多重mRNA原位分析法來(lái)捕獲CTC細(xì)胞，采用多重RNA探針，分別針對(duì)多種CTC特異性基因，來(lái)捕捉CTC細(xì)胞。CanPatrolTM系統(tǒng)的檢測(cè)技術(shù)是目前唯一可以同步實(shí)現(xiàn)CTC形態(tài)分型、細(xì)胞分型以及分子分型的方法，通過(guò)納米過(guò)濾技術(shù)來(lái)富集CTC，而不需要依賴(lài)特異生物標(biāo)志物（如EpCAM），進(jìn)而減少非小細(xì)胞肺癌患者CTC細(xì)胞的丟失，具有可重復(fù)性、高特異性、高靈敏度等優(yōu)點(diǎn)[20]。這同以往的CTC-Chip技術(shù)不同，這是基于分子水平上的檢測(cè)，相比較而言結(jié)果準(zhǔn)確。

綜上所述，非小細(xì)胞肺癌患者采用一線、二線化療時(shí)動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)CTC細(xì)胞數(shù)有助于評(píng)估臨床療效，且與預(yù)后具有相關(guān)性，有助于指導(dǎo)臨床治療，值得推廣應(yīng)用。

參考文獻(xiàn)

[1]涂長(zhǎng)玲，朱穎，董堅(jiān)，等.晚期非小細(xì)胞肺癌循環(huán)腫瘤細(xì)胞EGFR表達(dá)與細(xì)胞免疫的相關(guān)性研究[J].西部醫(yī)學(xué)，2016，28（9）：1221-1226.