高效液相色譜-發(fā)光二極管誘導(dǎo)熒光法快速檢測飼料中的苯并[a]芘

唐 濤， 彭俏容， 王風(fēng)云， 夏明珠， 李 彤， 張維冰

(1.南京理工大學(xué)工業(yè)化學(xué)研究所，江蘇南京 210094；2.大連依利特分析儀器有限公司，遼寧大連 116023；3.華東理工大學(xué)，上海市功能性材料化學(xué)重點實驗室，上海 200237)

苯并[a]芘(Benzo[a]pyrene，BaP)是一種常見的高活性間接致癌物，同時也是一種很強的致畸、致突變劑和內(nèi)分泌干擾物[1 - 2]，常存在于與我們?nèi)粘Ｉ钕⑾⑾嚓P(guān)的水體、食品、糧油中。因此，BaP的檢測一直是分析化學(xué)領(lǐng)域研究的熱點之一。早在1978年，Nakagawa所在課題組[3]便采用經(jīng)典的液液萃取-旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮的方法進(jìn)行樣品前處理，液相色譜聯(lián)用熒光檢測完成了對石蠟中BaP的測定。Shin等[4]采用固相萃取和旋蒸，高效液相色譜-熒光檢測法，比較了不同區(qū)域芝麻油中BaP含量的差異。Sekerolu等[5]采用類似的前處理方法，液相色譜-紫外檢測，完成了40種植物油中BaP的分析，其中16種檢出含量超過10 μg/kg。隨后，科研工作者們?yōu)榱双@取更清晰的檢測信號、更快的分析速度，在前處理上嘗試了不同的方法。Lin等[6]引入超聲輔助提取技術(shù)，旋蒸結(jié)合熒光光譜的方法，實現(xiàn)對液態(tài)牛奶的快速檢測。Nogami等[7]發(fā)展了一種名為BR的纖維，結(jié)合固-液提取技術(shù)，完成對自然水體里的BaP的監(jiān)測。Abdulkadar等[8]利用玻璃硅膠柱凈化，液液萃取和兩次旋蒸完成對橄欖油中BaP的提取，并用氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜(GC-MS/MS)進(jìn)行檢測。Conchione等[9]發(fā)展了一種固相微萃取的前處理方法，利用GC-MS測定食品添加劑微晶蠟中的BaP。

飼料是人類食物鏈中的重要一環(huán)，動物若長期攝入被BaP污染的飼料，其體內(nèi)的BaP通過富集作用逐漸在體內(nèi)蓄積，人類通過食物鏈的傳遞，也會受到一定程度的危害。但是，飼料中BaP的測定鮮有報道，現(xiàn)行農(nóng)業(yè)標(biāo)準(zhǔn)(NY/T919-2004)[10]通過振蕩提取-離心-旋蒸-洗滌-振蕩提取-固相萃取-旋蒸等七個步驟，進(jìn)行樣品預(yù)處理，采用紫外檢測器在296 nm下檢測，步驟繁瑣，對操作人員要求較高。

基于自構(gòu)建的一種新型發(fā)光二極管(Light Emitting Diode,LED)誘導(dǎo)熒光檢測器，本文對樣品前處理方法進(jìn)一步簡化，發(fā)展了一種高效液相色譜-LED誘導(dǎo)熒光法快速檢測飼料中BaP的新方法，并獲得了較好的實驗結(jié)果。

1 實驗部分

1.1 儀器及試劑

LED誘導(dǎo)熒光檢測器(自構(gòu)建)；P230Ⅱ高壓恒流泵、EC2006色譜數(shù)據(jù)工作站、色譜柱Hypersil BDS C18(250×4.6 mm i.d.，5 μm)(大連依利特分析儀器有限公司)；7725i手動進(jìn)樣器(美國，Rheodyne公司)；AE100S電子天平(瑞士，Mettler Toledo)；QL-861漩渦混合器(寧波，Biocotek)；WB-1010A超聲波清洗儀(天津奧特賽恩斯儀器有限公司)。

BaP對照品(純度>95%，TCI(上海)化成工業(yè)發(fā)展有限公司)溶液(100 μg/mL)：準(zhǔn)確稱取5.0 mg(精確到0.1 mg)BaP芘對照品至50 mL容量瓶中，用乙腈溶解并定容后，置于4 ℃冰箱中保存。準(zhǔn)確移取1 mL標(biāo)準(zhǔn)儲備液，置于100 mL容量瓶中，用乙腈稀釋至刻度。分別準(zhǔn)確移取一定體積的該溶液，加乙腈配制成濃度為0.5、1.0、5.0、10.0、25.0 ng/mL的標(biāo)準(zhǔn)工作液。乙腈、甲醇(色譜純，美國Tedia試劑公司)；丙酮(分析純，天津科密歐化學(xué)試劑有限公司)；實驗用水為Milli-Q超純水。

1.2 樣品前處理

飼料(市售)樣品經(jīng)粉碎機粉碎后，裝入磨口瓶中備用。稱取試樣3 g(精確到0.001 g)置于50 mL塑料離心管中。加入5 mL乙腈，渦旋振蕩3 min，超聲提取30 min。靜置分層，取1 mL上清液用0.45 μm有機濾膜過濾，備用。

2 結(jié)果與討論

2.1 LED誘導(dǎo)熒光檢測器的構(gòu)建

圖1 LED誘導(dǎo)熒光檢測器光路圖Fig.1 Schematic diagram of LED induced fluorescence detector1.365 nm LED；2.biconvex lens；3.dichroscope；4.lens；5.flow cell；6.430 nm pass-band filter；7.lens；8.PMT.

誘導(dǎo)熒光技術(shù)是一種高效檢測技術(shù)，其選擇性好、靈敏度高，在BaP檢測中也有應(yīng)用報道[11]；LED是近年來迅速發(fā)展的新型光源，有報道表明LED成本更低、壽命更長，可很好的替代激光器[12 - 13]。本文構(gòu)建了一種LED誘導(dǎo)熒光檢測器，光路原理圖如圖1所示。采用共聚焦結(jié)構(gòu)，簡化了光路設(shè)計；利用全反射式檢測池，有效增加了信號強度。主體的光路系統(tǒng)主要包括365 nm高強度LED、雙凸透鏡、二色鏡、透鏡組、反射式檢測池、430 nm帶通濾光片、凸透鏡和光電倍增管。LED光源發(fā)出激發(fā)光，經(jīng)雙凸透鏡轉(zhuǎn)為平行光，經(jīng)二色鏡反射后，垂直通過透鏡聚焦到檢測窗口，激發(fā)檢測窗口中的樣品產(chǎn)生熒光；產(chǎn)生的熒光，即發(fā)射光經(jīng)檢測池反射，通過透鏡轉(zhuǎn)成平行光，通過二色鏡和帶通濾光片，最后經(jīng)透鏡聚焦后匯聚到光電倍增管，在此處轉(zhuǎn)化為電信號，完成檢測。

2.2 LED誘導(dǎo)熒光法檢測飼料中BaP的方法

2.2.1樣品前處理的優(yōu)化BaP是由5個苯環(huán)構(gòu)成的多環(huán)芳烴，極性小，通常采用正己烷、環(huán)己烷、二氯甲烷等非極性溶劑提取。由于飼料樣品往往含有色素、脂肪等復(fù)雜成分，溶劑強度過強容易引入過多的雜質(zhì)，給后續(xù)的凈化增加難度?？紤]到LED誘導(dǎo)熒光檢測器選擇性高、干擾少，且主要針對微量及痕量BaP的快速提取，實驗中簡化了前處理步驟，分別考察了乙腈、甲醇、乙腈/甲醇(1∶1)、乙腈/丙酮(1∶1) 4種提取溶劑對加標(biāo)濃度為1.0 μg/kg樣品的回收率。實驗表明，采用乙腈的平均回收率超過90%，且乙腈可以作為后續(xù)色譜分離的流動相，具有很好的分離選擇性和兼容性，所以選擇乙腈作為提取溶劑。與此同時，考察了超聲時間對提取效率的影響，選擇30 min作為實驗條件。

圖2 苯并[a]芘對照品和加標(biāo)樣品疊加色譜圖Fig.2 Stacked chromatograms of benzo[a]pyrene reference and spiked sampleConditions:mobile phase:ACN/H2O(80∶20,V/V);flowrate:1.0 mL/min;injection volume:20 μL;temperature:40 ℃;detection:excitation and emission wavelength at 365/430 nm;sample a:reference of 10 ng/mL concentration;sample b:unknown sample with spiked concentration of 5 μg/kg.

2.2.2色譜分離條件的優(yōu)化對照品和加標(biāo)樣品的疊加色譜圖如圖2所示，BaP對照品的保留時間為13.64 min。根據(jù)BaP熒光光譜圖顯示，在290 nm和365 nm處分別有較為明顯的響應(yīng)。考慮到290 nm可能存在其他干擾物質(zhì)的影響，實驗選擇了更具特征性的365 nm。同時，由于檢測條件的高選擇性和高靈敏度，洗脫條件選擇了更為簡單通用的等度洗脫方式，并采用了乙腈/水作為流動相。

2.3 方法學(xué)驗證

實驗考察了BaP在濃度0.5～25 ng/mL范圍內(nèi)與色譜峰面積的線性相關(guān)性，以濃度(x)對峰面積(y)擬合線性方程:y=5.54x+0.0224，相關(guān)系數(shù)r2=1.0000，說明線性良好。以信噪比(S/N)大于30的某濃度BaP標(biāo)準(zhǔn)工作液為樣品，不斷稀釋并進(jìn)樣分析，直至某個濃度樣品的S/N=10時的濃度定為儀器的定量限，根據(jù)前處理步驟折算方法的定量限(Limit of Quantification，LOQ)為0.83 μg/kg；S/N=3時的濃度定為儀器的檢出限，折算方法檢出限為0.23 μg/kg。

選取一種陰性飼料樣品，分別在1.0、5.0、20.0 μg/kg 3個添加濃度水平進(jìn)行加標(biāo)回收率實驗。按照發(fā)展的方法進(jìn)行提取和測定，平行7次實驗，結(jié)果如表1所示。加標(biāo)濃度下回收率在81%～105%之間，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)值均小于10%。

表1 陰性加標(biāo)樣品測試結(jié)果(n=7)

2.4 與行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)(NY/T919-2004)比較

由表2可知，行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)(NY/T919-2004)提供了飼料中BaP檢測的HPLC-UV分析方法，檢出限為2.5 μg/kg。本實驗建立的HPLC-LED誘導(dǎo)熒光檢測法檢出限0.23 μg/kg，比行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)低一個數(shù)量級。更重要的是，行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)須采用多步驟的前處理方式來去除雜質(zhì)、提高目標(biāo)物濃度，本文發(fā)展的方法基于自構(gòu)建LED誘導(dǎo)熒光檢測器選擇性好、靈敏度高的優(yōu)點，降低了對前處理步驟的要求，縮短了分析時間、減少了溶劑消耗量。

表2 傳統(tǒng)方法和本文發(fā)展的方法參數(shù)比較

*:the analysis time is averaged by 10 samples per batch.

2.5 實際樣品分析

對于市售的8種飼料，按照1.2節(jié)所述方法進(jìn)行前處理，在優(yōu)化的色譜條件下進(jìn)行分析檢測，結(jié)果見表3。其中，5個樣品中檢出BaP，濃度在1.27～1.96 μg/kg范圍。檢出值低于行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)(NY/T919-2004)的檢出限(2.5 μg/kg)。

表3 飼料樣品中苯并[a]芘的測試結(jié)果

ND：not detected(the sample content < limit of detection).

3 結(jié)論

基于自構(gòu)建的新型LED誘導(dǎo)熒光檢測器，采用乙腈直接提取的方式，發(fā)展了一種快速檢測飼料中BaP的方法。實驗結(jié)果表明，該方法前處理步驟簡單，單個樣品的平均前處理時間由傳統(tǒng)方法的1 h縮短至5 min，樣品處理量減少為3 g，溶劑消耗量僅為5 mL。為飼料中BaP的快速篩選提供了參考。