樺褐孔菌水提粉的抗氧化性及對人體經(jīng)絡(luò)電壓的作用初探

饒平凡 陳 琦 周河美 許明明 林鵬輝 郭靜科 柯李晶 周建武* 劉樹滔

（1 中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院-浙江工商大學(xué)食品營養(yǎng)科學(xué)聯(lián)合研究中心 杭州310035 2 泉州師范學(xué)院海洋與食品學(xué)院 福建泉州362000 3 澳門錫伯爾科技發(fā)展有限公司 澳門4 福州大學(xué)至誠學(xué)院 福州350000 5 福州大學(xué)生物工程研究所 福州350000）

樺褐孔菌【Inonotus obliquus （Fr.）pilat】，常稱為白樺茸，又叫作西伯利亞靈芝，主要分布在俄羅斯、日本北海道、芬蘭、波蘭等北半球北緯40°～50°地區(qū)，在我國主要分布在吉林長白山、黑龍江大興安嶺等寒冷地區(qū)。 它是主要寄生在白樺、銀樺、榆樹、赤楊等樹皮下的一種特殊真菌[1]，具有一定的藥用價值及保健功能[2]，并作為保健品開發(fā)出多種產(chǎn)品[3]。 樺褐孔菌具有良好的抗氧化功效[4-5]，能夠預(yù)防和延緩氧化損傷導(dǎo)致的多種疾病[6]。 其中，許麗璇等[1]通過動物體內(nèi)外實(shí)驗證實(shí)了樺褐孔菌能夠抑制體內(nèi)肝臟脂質(zhì)過氧化物MDA 生成，抑制H2O2誘導(dǎo)紅細(xì)胞氧化溶血，具備體外清除·OH自由基和DPPH 自由基的能力。

中國傳統(tǒng)對食物的功能性評價離不開經(jīng)絡(luò)學(xué)說。對不同食物依據(jù)性味歸經(jīng)原理進(jìn)行分類，并且由此指導(dǎo)使用[7]。 歸經(jīng)，把食物的作用與臟腑聯(lián)系起來，即食物作用的定位，說明食物作用對機(jī)體某部分生理功能的選擇性。如菠菜具有滋陰潤燥、養(yǎng)血止血、止渴潤腸的作用，歸胃、腸經(jīng)；絲瓜具有清熱解毒涼血、祛風(fēng)化痰通絡(luò)的作用，歸肝、胃經(jīng)；小麥具有養(yǎng)心除煩、健脾益腎、除熱止渴的作用，歸心經(jīng)；芹菜具有平肝清熱的作用，歸肝經(jīng)[8]。雖然食物性味歸經(jīng)的客觀指標(biāo)和機(jī)理尚未明確， 但是在前期的工作中， 采用監(jiān)測經(jīng)絡(luò)電壓的方法客觀評價紅茶（金駿眉）、烏龍茶（武夷水仙）和綠茶（高山綠茶）3 種茶湯的攝入對人體不同經(jīng)絡(luò)的作用，明確茶湯對小腸經(jīng)的歸經(jīng)作用[9]。人體的經(jīng)絡(luò)電壓的變化和抗氧化密切相關(guān)[10]，這是因為在經(jīng)絡(luò)上發(fā)現(xiàn)存在大量的自由基[11]，可以通過對特定經(jīng)絡(luò)進(jìn)行抗氧化治療達(dá)到降低單純性肥胖患者體重[12-13]和改善過敏性鼻炎癥狀[14]的效果。 本研究采用經(jīng)絡(luò)電壓監(jiān)測方法來探究樺褐孔菌的歸經(jīng)特質(zhì)，從食品角度探討人體經(jīng)絡(luò)電壓檢測方法監(jiān)測氧化應(yīng)激狀態(tài)的可能性。同時，對樺褐孔菌水提粉進(jìn)行體外氧化還原電位、總抗氧化力和SOD 活力檢測分析， 多角度對比分析樺褐孔菌的抗氧化性對機(jī)體氧化應(yīng)激處理系統(tǒng)的作用。

1 材料與方法

1.1 材料與主要儀器

1.1.1 樺褐孔菌的來源 樺褐孔菌水提粉由澳門錫伯爾科技發(fā)展有限公司提供。 將野生樺褐孔菌（白樺茸）子實(shí)體經(jīng)過水洗、干燥、打粉后，用純化水提取，后經(jīng)離心過濾、濃縮、純化，最后冷凍干燥加以包裝。 其中多糖成分大于30%， 含量（CP2010）三萜2%～8%、多酚>5%。

1.1.2 SOD 的來源 SOD 由福州大學(xué)生物工程研究所提供，將構(gòu)建好的含有TAT-SOD 基因的高表達(dá)克隆接種于100 mL 含50 g/mL Amp 的LB 培養(yǎng)基中，37 ℃搖培過夜；菌液按2%接種量接種于1 000 mL 新鮮的LB 培養(yǎng)基中（含50 g/mL Amp），37 ℃搖培到OD600=0.6～0.8， 加入IPTG 至終濃度為250 mol/L，CuSO4500 mol/L，ZnSO4100 mol/L，25 ℃振搖誘導(dǎo)培養(yǎng)6 h； 菌液5 000 r/min 離心15 min，收集菌體，用100 mL PBS 重懸，冰浴中超聲破碎30 min，12 000 r/min 離心10 min， 上清液用0.22 m 膜過濾備用。 上清液經(jīng)過GST 融合蛋白親和色譜柱提純獲得SOD 蛋白。所獲得SOD 蛋白比活力＞50 000 U/g[15]。

1.1.3 菌湯的制備 樺褐孔菌湯： 準(zhǔn)確稱取樺褐孔菌水提粉2.0 g， 用37 ℃的蒸餾水定容到100 mL。

SOD 樺褐孔菌湯： 準(zhǔn)確稱取樺褐孔菌水提粉2.0 g，SOD 酶0.2 g， 用37 ℃的蒸餾水定容到100 mL。

1.1.4 主要試劑和儀器 SOD 試劑盒（測總）、總抗氧化能力（T-AOC）試劑盒，南京建成生物工程研究所；氧化還原電位計（Inlab Redox），梅特勒-托利多（上海）有限公司；Ag/AgCl 一次性使用心電電極，上海鈞康醫(yī)用設(shè)備有限公司；多通道生理信號采集處理系統(tǒng)（RM6240C），成都儀器廠。

1.2 方法

1.2.1 菌湯的抗氧化活性檢測 菌湯的總SOD活力與總抗氧化能力（T-AOC）通過相應(yīng)試劑盒測定。 菌湯的氧化還原電位值為菌湯直接測得的氧化還原電位值減去蒸餾水的氧化還原電位值[16]。

1.2.2 試驗對象 30 名健康志愿者在知情同意后進(jìn)行試驗。 參加試驗的受試者需要符合以下要求：（1）年齡：20～35 歲；（2）沒有歷史性或者體檢發(fā)現(xiàn)的腎、肝、心血管疾病或者其它嚴(yán)重器質(zhì)性疾??；（3）有規(guī)律的飲食，最低限量的飲酒、抽煙、茶和咖啡，有正常睡眠模式（晚上12 點(diǎn)前入睡）；（4）沒有長期的藥物治療；（5）沒有濫用毒品史；（6）在試驗前1 個月內(nèi)， 沒有經(jīng)歷過針灸或者其它穴位干擾行為，沒有服用過任何藥物。這個研究獲得中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院-浙江工商大學(xué)食品營養(yǎng)科學(xué)聯(lián)合研究中心倫理委員會認(rèn)可。

1.2.3 試驗分組 志愿者經(jīng)招募后， 隨機(jī)分為2組，每組15 人，分別服用樺褐孔菌湯（菌粉組）和SOD 樺褐孔菌湯（SOD 菌粉組）。

1.2.4 試驗方案 選擇各條經(jīng)絡(luò)的合穴和原穴（表1）作為經(jīng)絡(luò)電壓的測量點(diǎn)，分別以合穴為正極，原穴為負(fù)極。所有試驗對象在第0 天進(jìn)行經(jīng)絡(luò)電壓的測量，所得的經(jīng)絡(luò)電壓作為空白組，后開始分別服用樺褐孔菌湯（菌粉組）和SOD 樺褐孔菌湯（SOD 菌粉組），每天服用100 mL，持續(xù)服用24 d，第24 天再測量經(jīng)絡(luò)電壓，所得為菌粉組和SOD菌粉組的經(jīng)絡(luò)電壓。 測量前試驗對象需仰臥在床上并保持清醒狀態(tài)，然后讓其深呼吸安靜下來。穴位的選擇和確定參照中國國家標(biāo)準(zhǔn)GB/T12346[17]，將測量穴位點(diǎn)附近毛發(fā)修剪， 用醫(yī)用酒精進(jìn)行擦拭，等其揮發(fā)后，按標(biāo)準(zhǔn)尋找出穴位。使用Ag/AgCl一次性心電電極貼粘貼穴位處， 連接電極和數(shù)據(jù)采集儀，開始采集數(shù)據(jù)。

表1 經(jīng)絡(luò)電壓的測量點(diǎn)Table 1 The selected acupuncture points

1.3 數(shù)據(jù)處理方法

采用SPSS for windows 13.0 統(tǒng)計軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，測定樣本結(jié)果以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示。

2 結(jié)果與討論

2.1 菌湯的抗氧化活性檢測結(jié)果

氧化還原電位用于反映溶液中所有物質(zhì)表現(xiàn)出來的宏觀氧化還原性。氧化還原電位越高，氧化性越強(qiáng)，電位越低，氧化性越弱。作為溶劑，蒸餾水有自身的氧化還原電位值[18]。 由表2 所示，樺褐孔菌湯與SOD 樺褐孔菌湯的氧化還原電位分別是-226.6，-245.3 mV，彼此之間差異不顯著，都能降低蒸餾水的氧化還原電位。 加入樺褐孔菌粉與SOD樺褐孔菌粉，溶液的氧化電位值分別降低，意味著樺褐孔菌富含抗氧化性物質(zhì)，主要是多糖、多酚、黃酮、單寧化合物、黑色素和三萜類等[19-20]。

SOD 作為超氧自由基的特異性催化酶， 抑制超氧自由基的生成， 無法作為反應(yīng)物直接和氧化物發(fā)生反應(yīng)，降低菌湯的氧化還原電位值。從菌湯的總抗氧化力和SOD 活力測定結(jié)果可以發(fā)現(xiàn)，樺褐孔菌湯的總抗氧化力為8 364.0 U/g，SOD 活力為5 611.3 U/g，具有SOD 活性，能夠起到抑制自由基生成和脂質(zhì)過氧化。 已有文獻(xiàn)證明服用樺褐孔菌能有效提高血清、腦、心、肝、肺的SOD、CAT、GSH-Px 活性及總抗氧化力（T-AOC），降低脂質(zhì)過氧化物MDA 含量[21-22]。 SOD 樺褐孔菌湯因為添加了SOD 蛋白， 對超氧自由基有更好的抗氧化作用，總抗氧化力測定結(jié)果為9 997.2 U/g，SOD 活力為11 683.7 U/g，高于樺褐孔菌湯所測結(jié)果，進(jìn)一步加強(qiáng)了整體抗氧化力。

表2 菌湯的抗氧化活性檢測結(jié)果Table 2 The anti-oxidative capacity of extract powder of Inonotus obliquus and enhanced SOD Inonotus obliquus

2.2 樺褐孔菌對經(jīng)絡(luò)電壓的影響

2.2.1 樺褐孔菌作用的經(jīng)絡(luò) 由圖1 所示， 菌粉組和SOD 菌粉組受試者的心經(jīng)與心包經(jīng)電壓顯著升高。心經(jīng)與心包經(jīng)都與心血管功能相關(guān)，心經(jīng)甚至與腦、神志相關(guān)[23]。 樺褐孔菌可顯著降低高脂血癥大鼠的血清三酰甘油、總膽固醇、低密度脂蛋白及脂質(zhì)過氧化物MDA 含量，提高血清高密度脂蛋白含量及SOD 活性[24]，還對糖尿病大鼠具有降血糖、調(diào)脂、抗氧化應(yīng)激、清除自由基以及改善受損肝功能的作用， 其作用機(jī)制與其所含多糖的降血糖作用和單寧酸的抗氧化清除自由基作用有關(guān)[25]。 樺褐孔菌也可以通過提高大腦SOD 和CAT的活性，降低脂質(zhì)過氧化物MDA 的含量，對血管性癡呆起到保護(hù)作用[26]。 當(dāng)志愿者服用樺褐孔菌后，血液中的過剩自由基被清除，血脂降低，心血管系統(tǒng)得到改善，并且對大腦有保護(hù)作用，在電壓上的表現(xiàn)是心經(jīng)和心包經(jīng)電壓升高。

圖1 樺褐孔菌粉與SOD 樺褐孔菌粉對人體心經(jīng)（a）、心包經(jīng)（b）經(jīng)絡(luò)電壓的影響Fig.1 The effects on electric potential difference of Heart （a）and Pericardium （b）Meridian by extract powder of Inonotus obliquus and enhanced SOD Inonotus obliquus

2.2.2 SOD 加強(qiáng)樺褐孔菌作用的經(jīng)絡(luò) 由圖2 所示，菌粉組和SOD 菌粉組志愿者的肺經(jīng)電壓顯著升高，SOD 菌粉組升高的程度大于菌粉組。肺經(jīng)對應(yīng)的是呼吸系統(tǒng)，肺是人體的呼吸器官，肺組織細(xì)胞的損傷主要由過剩的自由基引起[27]，受到損傷后的肺泡巨噬細(xì)胞也會產(chǎn)生大量自由基[28]。 樺褐孔菌能提高急性弓形蟲小鼠肺的SOD 活性，減少氧化應(yīng)激損傷[29]。 當(dāng)志愿者服用抗氧化性高的樺褐孔菌粉和SOD 樺褐孔菌粉后，肺部過剩自由基得到清除， 尤其樺褐孔菌粉中添加超氧自由基的特異性催化酶SOD， 對肺部的自由基清除作用加強(qiáng)， 肺功能得到進(jìn)一步改善， 進(jìn)一步升高肺經(jīng)電壓。

圖2 樺褐孔菌粉與SOD 樺褐孔菌粉對人體肺經(jīng)經(jīng)絡(luò)電壓的影響Fig.2 The effects on electric potential difference of Lung Meridian by extract powder of Inonotus obliquus and enhanced SOD Inonotus obliquus

2.2.3 SOD 作用的經(jīng)絡(luò) 由圖3 所示， 菌粉組脾經(jīng)、 膀胱經(jīng)和肝經(jīng)電壓沒有顯著變化， 但是SOD菌粉組顯著增加。 脾經(jīng)對人體的免疫系統(tǒng)有至關(guān)重要的作用[30]，而肝經(jīng)和膀胱經(jīng)對應(yīng)著人體解毒排毒的重要功能，與氧化應(yīng)激密切相關(guān)。樺褐孔菌在添加SOD 蛋白后，能夠?qū)σ陨辖?jīng)絡(luò)產(chǎn)生作用。

圖3 樺褐孔菌粉與SOD 樺褐孔菌粉對人體脾經(jīng)（a）、膀胱經(jīng)（b）和肝經(jīng)（c）經(jīng)絡(luò)電壓的影響Fig.3 The effects on electric potential difference of Spleen Meridian （a）， Bladder Meridian （b）and Liver Meridian （c）by extract powder of Inonotus obliquus and enhanced SOD Inonotus obliquus

其余的大腸經(jīng)、胃經(jīng)、小腸經(jīng)、腎經(jīng)、三焦經(jīng)和膽經(jīng)，菌粉組和SOD 菌粉組的經(jīng)絡(luò)電壓無顯著變化（圖4）。

圖4 樺褐孔菌粉與SOD 樺褐孔菌粉對人體大腸經(jīng)、胃經(jīng)、小腸經(jīng)、腎經(jīng)、三焦經(jīng)和膽經(jīng)經(jīng)絡(luò)電壓的影響Fig.4 The effects on electric potential difference of Large Intestine Meridian， Stomach Meridian， Small Intestine Meridian， Kidney Meridian， Triple Energizer Meridian and Gall Bladder Meridian by extract powder of Inonotus obliquus and enhanced SOD Inonotus obliquus

3 結(jié)論

樺褐孔菌水提粉有很強(qiáng)的抗氧化性， 當(dāng)志愿者服用樺褐孔菌粉和SOD 樺褐孔菌粉24 d 后，能夠顯著性改變心經(jīng)、心包經(jīng)和肺經(jīng)電壓，而且SOD樺褐孔菌粉在添加SOD 蛋白后還能顯著性地提高膀胱經(jīng)、脾經(jīng)、肝經(jīng)電壓，這和已報道的樺褐孔菌的功效描述基本吻合。 以上結(jié)果進(jìn)一步說明通過測量經(jīng)絡(luò)穴位電壓能一定程度反映樺褐孔菌對人體的作用， 測量經(jīng)絡(luò)穴位電壓能夠作為一種新的安全、無創(chuàng)傷手段，客觀評價食品對人體的功效作用， 為評價食品功效和新食品的開發(fā)提供一個全新的視角， 也揭示了食品除了提供營養(yǎng)和能量外還具有調(diào)節(jié)人體氧化應(yīng)激處理體系的作用。