甘薯葉綠原酸的微波協(xié)同雙水相提取及其抗氧化活性

蔣益花 蔣新龍

(浙江樹人大學(xué)生物與環(huán)境工程學(xué)院，杭州 310015)

甘薯葉作為甘薯的副產(chǎn)品之一，少部分用作飼料外，加工利用度低，而其中富含綠原酸類化合物[1-2]。

綠原酸是含有羧基和鄰二苯酚羥基的苯丙素類有機(jī)酸。現(xiàn)代醫(yī)學(xué)與天然產(chǎn)物研究發(fā)現(xiàn)，綠原酸在人體中具有顯著的抗氧化、抗衰老、抗腫瘤、抑菌消炎、預(yù)防心血管疾病、防曬以及改善認(rèn)知等功能[3-5]。

目前，綠原酸的提取方法主要有：浸提法[1-2]、微波法[6]、超聲波法[7]、酶解法[8]、超臨界流體萃取法[9]、半仿生提取法[10]、液膜法[11]、索氏提取法[12]等方法。浸提法得率較低，操作時(shí)間長，有機(jī)溶劑對(duì)環(huán)境污染大；索氏提取法易出現(xiàn)費(fèi)時(shí)和溶劑用量過大問題；酶解法工藝操作控制較嚴(yán)格，因需調(diào)節(jié)酸堿度易造成部分酚類物質(zhì)氧化而被破壞；超臨界二氧化碳萃取法綠原酸氧化損失少、提取的產(chǎn)品質(zhì)量較好、提取效率較高，但設(shè)備投資高不適合大規(guī)模生產(chǎn)；液膜法產(chǎn)品純度低，膜價(jià)格高，過濾速度慢；超聲波輔助提取法簡便快捷、提取溫度低、時(shí)間短、得率高，但獲得產(chǎn)品純度不高；半仿生提取法產(chǎn)品純度低。雙水相萃取是根據(jù)組分在兩相間的選擇性分配而達(dá)到目標(biāo)成分分離的目的[13]，因其操作條件較溫和、分離過程可控、操作簡單等優(yōu)點(diǎn)，所以易于工業(yè)放大；尤其適用于具有生物活性的生物物質(zhì)的分離和提純[13]。目前，雙水相體系用于綠原酸分離純化的研究報(bào)道較多[14-15]，但直接用于提取綠原酸的極少。本研究排除成本高、體系黏度大、回收難的高聚物雙水相體系，直接用有機(jī)溶劑水溶液和一定量的無機(jī)鹽配成雙水相體系作為提取劑進(jìn)行微波協(xié)同提取綠原酸，并考察了所提取甘薯葉綠原酸的抗氧化活性，為甘薯葉資源化開發(fā)利用提供借鑒。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

紅心番薯葉[red.fleshIpomoeabatatas(L.)Lam.leaves]于2016年4月上旬采自浙江省諸暨市次塢鎮(zhèn)種植地。將采摘的新鮮甘薯葉除去泥沙、黃葉等，再用清水漂洗干凈，50 ℃鼓風(fēng)干燥72 h，粉碎過60目篩，放入自封袋中，置于干燥器中備用。綠原酸標(biāo)準(zhǔn)品購于中國藥品生物制品檢定所；所用其他試劑均為國產(chǎn)分析純；所用水為蒸餾水。

D8017Tl-2H型格蘭仕微波爐；7220型分光光度計(jì)；GZX-91400MBE電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱。

1.2 方法

1.2.1 綠原酸含量的測(cè)定

采用紫外分光光度法測(cè)定綠原酸含量[16]。以20 μg/mL的綠原酸為標(biāo)準(zhǔn)溶液制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。精密量取1.00、2.50、3.75、5.00、6.25 mL綠原酸標(biāo)準(zhǔn)溶液，放置于10 mL容量瓶中，用75%乙醇定容，將綠原酸標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照品配制成2.0、5.0、7.5、10.0、12.5 μg/mL 5個(gè)質(zhì)量濃度的溶液，在329 nm波長下測(cè)定其吸光度A。以綠原酸質(zhì)量濃度C(μg/mL)作橫軸，吸光度A為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到綠原酸質(zhì)量濃度C(μg/mL) 與吸光度A之間的回歸方程為：A=0.053 1C+0.013 02，線性范圍0～12.5 μg/mL，相關(guān)系數(shù)R2=0.999 9。吸取甘薯葉粗提液適量，同法測(cè)定其吸光值，根據(jù)回歸方程計(jì)算綠原酸含量。

式中：C為回歸方程計(jì)算所得值；V為粗提液總體積。

1.2.2 微波協(xié)同雙水相體系提取工藝實(shí)驗(yàn)

提取方法：稱取0.500 0 g甘薯葉粉末樣品于500 mL燒杯中，加入一定體積的有機(jī)溶劑溶液和一定質(zhì)量的無機(jī)鹽，在一定微波功率條件下微波處理一定時(shí)間，趁熱抽濾得濾液。靜置5 min，待其分層，收集上清液，得到甘薯葉綠原酸粗提液(Sweet Potato Leaf Chlorogenic acid extract，SCE)，測(cè)定綠原酸含量。

單因素實(shí)驗(yàn)：稱取0.500 0 g紅薯葉粉末樣品，按照1.2.2方法對(duì)綠原酸提取過程中的乙醇體積分?jǐn)?shù)、磷酸氫二鉀用量、提取時(shí)間、液料比和微波功率五因素分別進(jìn)行水平篩選及優(yōu)化。設(shè)置液料比100∶1(V/m)，50%的乙醇溶液，微波功率320 W提取時(shí)間30 s，考察析相鹽磷酸氫二鉀用量(3.0、4.0、5.0、6.0、7.0 g)對(duì)綠原酸得率的影響；設(shè)置液料比100∶1(V/m)，磷酸氫二鉀5.0 g，微波功率320 W提取時(shí)間30 s，考察有機(jī)相乙醇體積分?jǐn)?shù)(30%、40%、50%、60%、70%)對(duì)綠原酸得率的影響；設(shè)置50%的乙醇溶液，磷酸氫二鉀5.0 g，微波功率320 W提取時(shí)間30 s，考察液料比(40∶1、60∶1、80∶1、100∶1、120∶1V/m)對(duì)綠原酸得率的影響；設(shè)置液料比100∶1(V/m)，50%的乙醇溶液，磷酸氫二鉀5.0 g，微波功率320 W，考察提取時(shí)間(15、30、45、60、75、90、100 s)對(duì)綠原酸得率的影響；設(shè)置液料比100∶1(V/m)，50%的乙醇溶液，磷酸氫二鉀5.0 g，提取時(shí)間75 s，考察微波功率(160、320、480、640、800 W)對(duì)綠原酸得率的影響。

正交優(yōu)化實(shí)驗(yàn)：在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，以無機(jī)鹽用量為固定值，選取有機(jī)溶劑體積分?jǐn)?shù)、液料比、提取時(shí)間和微波功率4個(gè)因素為自變量，以綠原酸得率為評(píng)價(jià)指標(biāo)，利用正交實(shí)驗(yàn) L9(34)對(duì)提取條件進(jìn)行優(yōu)化。

1.2.3 抗氧化活性實(shí)驗(yàn)

DPPH·法是用以評(píng)價(jià)天然抗氧化劑抗氧化活性的一種簡便快速、靈敏可行的方法[17-18]。根據(jù)文獻(xiàn)[19]并加以改進(jìn)，用無水乙醇配制2×10-4mol/L的DPPH·溶液。在10 mL具塞試管中加入2 mL所需濃度(2、4、8、10、16、20 μg/mL)的測(cè)定液和2 mL DPPH·溶液，總體積4 mL?；旌暇鶆?，室溫避光反應(yīng)30 min，以溶劑調(diào)零點(diǎn)，測(cè)定DPPH·混合溶液在517 nm處的的吸光值A(chǔ)。結(jié)果以清除率K表示。

式中：Ai為2 mL DPPH·溶液加入2 mL測(cè)定液的吸光度；Aj為2 mL測(cè)定液加入2 mL溶劑的吸光度；Ac為2 mL DPPH·溶液添加2 mL溶劑的吸光度。

1.3 統(tǒng)計(jì)方法及分析軟件

指標(biāo)均重復(fù)測(cè)定3次并取平均值，利用Origin8軟件作圖；應(yīng)用SPSS20.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)，并用Duncan多重比較(SSR法)檢驗(yàn)各處理平均數(shù)之間的差異顯著性(P<0.05)。

2 結(jié)果與分析

2.1 雙水相體系的確定

有機(jī)溶劑的確定：在離心管中分別加入相同體積的乙醇、丙酮、異丙醇三種有機(jī)溶劑，再分別加入定量的磷酸鹽和硫酸銨比較分相情況。結(jié)果表明，丙酮、乙醇的分相效果較好。考慮丙酮的毒性較大，所以選擇乙醇作為有機(jī)相。

分相鹽的確定：加入相同體積的乙醇溶液，再分別逐量0.5 g遞增地加入等量不同的鹽：硫酸銨、磷酸二氫鉀、無水硫酸鈉、碳酸鈉、碳酸氫鈉、氯化銨等。置于離心管中比較分相情況。結(jié)果表明，在乙醇/水雙水相萃取體系中，磷酸氫二鉀的分相能力強(qiáng)。與其他鹽不分層或難于分層。所以選取磷酸氫二鉀作為分相鹽。

2.2 單因素實(shí)驗(yàn)

2.2.1 磷酸氫二鉀用量的影響

實(shí)驗(yàn)結(jié)果見圖1。由于甘薯葉綠原酸屬于苯丙素類有機(jī)酸，易溶于弱堿性溶液，磷酸氫二鉀與乙醇形成的雙水相提取劑為弱堿性，有利于甘薯葉綠原酸的溶出。在乙醇-磷酸氫二鉀雙水相中，下相由溶解有磷酸氫二鉀的水及少量乙醇構(gòu)成，上相則由混有少量水的乙醇構(gòu)成，易溶于乙醇相的綠原酸提取出后進(jìn)入上相。雙水相的形成是磷酸氫二鉀與乙醇爭奪水分子的過程。隨著磷酸氫二鉀用量的增加，鹽對(duì)水的束縛能力增強(qiáng)，使上相中乙醇的相對(duì)體積分?jǐn)?shù)增加[20]。因此，鹽的用量改變可影響到上相的極性，最終影響到綠原酸的得率。由圖1可知，磷酸氫二鉀用量為5.0 g時(shí)，綠原酸的得率達(dá)到最高值。后續(xù)固定磷酸氫二鉀質(zhì)量濃度100 mg/mL，通過優(yōu)化調(diào)節(jié)乙醇體積分?jǐn)?shù)和用量獲得高選擇性雙水相體系。

圖1 甘薯葉綠原酸提取條件單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.2.2 乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)綠原酸得率的影響

由圖1可知，在50%時(shí)綠原酸的得率達(dá)到最高值。這是因?yàn)橐掖俭w積分?jǐn)?shù)直接影響雙水相萃取效果。水量過多無法形成雙水相體系，過少則鹽不能完全溶解；乙醇量太少也無法形成雙水相，太多則會(huì)導(dǎo)致鹽的析出。因此，初步確定乙醇最佳體積分?jǐn)?shù)為50%。

2.2.3 液料比對(duì)綠原酸得率的影響

由圖1可知，液料比在40～100∶1(V/m)范圍內(nèi)，綠原酸得率隨著液料比的增加而提高，當(dāng)液料比高于100∶1(V/m)時(shí)，綠原酸得率反而下降，可能是因?yàn)楫?dāng)液料比過大時(shí)，液體中間部分較難受到微波輻射，只能通過傳統(tǒng)方式受熱，使得傳熱速率下降，導(dǎo)致綠原酸得率下降[21]。因此，控制好一個(gè)適當(dāng)?shù)囊毫媳?，?huì)使體系達(dá)到一個(gè)較好的提取效果，故初步選取最佳液料比為100∶1(V/m)。

2.2.4 提取時(shí)間對(duì)綠原酸得率的影響

由圖1可知，在75 s時(shí)間內(nèi)，綠原酸得率隨提取時(shí)間增加而提高，但提取時(shí)間超過75 s時(shí)，綠原酸得率不增反降，這主要由于綠原酸中的酚羥基容易被氧化，長時(shí)間的微波提取并不能達(dá)到很好的提取效果，故初步選取最佳提取時(shí)間為75 s。

2.2.5 微波功率對(duì)綠原酸得率的影響

由圖1可知，在微波功率為160～800 W范圍內(nèi)，隨著微波功率的增加，綠原酸得率先增加后減少，在480 W時(shí)達(dá)到最大值。其主要原因可能是微波功率過高，體系升溫過快，加速了綠原酸的氧化與降解，使粗提液中綠原酸有效濃度下降。考慮到得率最高，初步選取最佳微波功率為480 W。

2.3 正交設(shè)計(jì)優(yōu)化綠原酸提取工藝

以單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果為基礎(chǔ)，采用4因素3水平的正交實(shí)驗(yàn)方法，對(duì)綠原酸提取工藝參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化，實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)和結(jié)果見表1，方差分析結(jié)果見表2。

表1 正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果

表2 方差分析表

注：因素C影響小，故作為方差分析的誤差處理；F0.05(2、2)=19.00，*表示因素影響顯著。

表1中K1、K2、K3表示每個(gè)因素所進(jìn)行3次實(shí)驗(yàn)所得的綠原酸得率的平均值。R為平均數(shù)的極差，R越大表明變化幅度大，說明該因素的水平變化對(duì)綠原酸得率的影響越大，該因素即是最大影響因素。由表1可以看出影響綠原酸得率的因素主次依次排列為：液料比(B)>提取時(shí)間(D)>乙醇濃度(A)>微波功率(C)。由表2可以看出，對(duì)綠原酸得率的影響液料比(B)顯著，其他都不顯著。直觀分析，實(shí)驗(yàn)的最優(yōu)水平組合為A1B2C2D2；根據(jù)每個(gè)因素K1、K2、K3實(shí)驗(yàn)的最優(yōu)水平組合為A2B2C2D2。Duncan法分析結(jié)果表明，乙醇濃度、微波功率三水平之間均無顯著差異。綜合分析提取成本和得率，確定最佳工藝條件A1B2C1D2，即乙醇體積分?jǐn)?shù)40%，液料比100∶1(V/m)，提取時(shí)間75 s，微波功率為320 W。

表3 對(duì)比實(shí)驗(yàn)結(jié)果

注：同列不同字母表示差異顯著P<0.05，下同。

2.4 工藝驗(yàn)證性實(shí)驗(yàn)

為考察優(yōu)選微波協(xié)同雙水相提取(簡稱：微波雙水相提取，下同)甘薯葉綠原酸工藝的穩(wěn)定性，稱取甘薯葉0.5000 g，按優(yōu)化的提取工藝條件進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，即磷酸氫二鉀質(zhì)量濃度100 mg/mL，40%乙醇溶液，微波功率320 W，微波時(shí)間75 s，液料比100∶1(V/m)。重復(fù)實(shí)驗(yàn)3次，計(jì)算綠原酸得率。同時(shí)吸取上層醇溶液，揮干溶劑，制成干浸膏，測(cè)定干浸膏中綠原酸的含量。分別精密稱取3份醇提浸膏，配制成一定質(zhì)量濃度的供試液，測(cè)定綠原酸含量。驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)結(jié)果，甘薯葉綠原酸得率分別為3.75%、3.73%、3.68%，平均為(3.72±0.036)%。干浸膏中綠原酸的質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為9.31%、9.40、9.42%，平均為(9.38±0.059)%。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明經(jīng)過正交實(shí)驗(yàn)優(yōu)選的提取工藝條件穩(wěn)定，適合規(guī)?；a(chǎn)。

2.5 對(duì)比實(shí)驗(yàn)

為了進(jìn)一步研究雙水相提取在得率和純度上的優(yōu)勢(shì)，進(jìn)行微波提取和微波雙水相提取的對(duì)比實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)條件和結(jié)果見表3。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，微波雙水相提取所得得率略小但差異不顯著(P>0.05)，但提取干浸膏中綠原酸的含量提高了2.2倍，說明雙水相提取的純度明顯提高。

2.6 抗氧化性實(shí)驗(yàn)

將甘薯葉綠原酸粗提液(SCE)分別配制成質(zhì)量濃度為2、4、8、12、16、20 μg/mL的供試品溶液，按照1.2.3方法測(cè)定對(duì)DPPH·的清除率，并以相同質(zhì)量濃度的綠原酸、VC作為陽性對(duì)照，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見圖2。根據(jù)圖2的量效關(guān)系構(gòu)建實(shí)驗(yàn)濃度和清除率的線性方程，并求出清除率為50%時(shí)所需的濃度(IC50)，見表4。表4表明，甘薯葉綠原酸粗提液、綠原酸和VC在實(shí)驗(yàn)濃度范圍內(nèi)與清除DPPH·自由基呈現(xiàn)出良好的量效關(guān)系。SCE清除DPPH·的能力(IC50=(12.29±0.33) μg/mL)強(qiáng)于對(duì)照物VC(IC50=(14.64±0.38)μg/mL)和綠原酸(IC50=(16.78±0.55)μg/mL)，SCE比綠原酸和VC對(duì)DPPH·的清除效果明顯(P<0.05)。

表4 甘薯葉綠原酸粗提液清除DPPH·自由基的能力

圖2 甘薯葉綠原酸粗提液清除DPPH·自由基的能力

3 討論

本研究使用乙醇、磷酸氫二鉀和水三種綠色材料，組成新型穩(wěn)定的乙醇-磷酸氫二鉀雙水相萃取體系。研究發(fā)現(xiàn)，分相鹽磷酸氫二鉀質(zhì)量分?jǐn)?shù)過高或有機(jī)相乙醇體積分?jǐn)?shù)過高都不利于甘薯葉綠原酸的提取。磷酸氫二鉀質(zhì)量分?jǐn)?shù)過高，可使上相中乙醇的相對(duì)體積分?jǐn)?shù)增加；乙醇體積分?jǐn)?shù)過高，會(huì)導(dǎo)致磷酸氫二鉀的析出。雙水相的形成是磷酸氫二鉀與乙醇爭奪水分子的過程[20]。通過優(yōu)化調(diào)整物質(zhì)組成，可獲得高選擇性萃取體系。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，乙醇-磷酸氫二鉀雙水相萃取體系中，以40%乙醇溶液、磷酸氫二鉀質(zhì)量濃度100 mg/mL組合為最佳。

本研究根據(jù)微波輔助萃取選擇性高、萃取效率高等特點(diǎn)，將雙水相萃取和微波輔助萃取相結(jié)合研究微波協(xié)同雙水相體系提取甘薯葉綠原酸工藝。在單因素基礎(chǔ)上，通過正交實(shí)驗(yàn)優(yōu)化了甘薯葉綠原酸工藝。結(jié)果表明，液料比對(duì)綠原酸得率的影響顯著，液料比是影響綠原酸得率的最主要因素。影響綠原酸得率的因素主次依次排列為：液料比>提取時(shí)間>乙醇濃度>微波功率。固定條件磷酸氫二鉀質(zhì)量濃度100 mg/mL下最佳提取工藝條件為乙醇濃度40%，液料比100∶1(V/m)，提取時(shí)間75 s，微波功率為320 W。該工藝條件下得率為(3.72±0.036)%，其干浸膏的綠原酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)為(9.38±0.059)%，而在不加入分相鹽的微波提取條件下得到的甘薯葉綠原酸的得率為(3.86±0.035)%，其干浸膏綠原酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)為(4.23±0.025)%。對(duì)比實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，加入分相鹽磷酸氫二鉀形成了水相體系，所得得率略小但差異不顯著(P>0.05)，主要是目標(biāo)物綠原酸進(jìn)入雙水相體系，表面性質(zhì)、電荷作用和氫鍵、離子鍵、疏水鍵以及環(huán)境等都會(huì)對(duì)綠原酸的分配造成影響[22]，使得其在上、下兩相中的濃度不同，綠原酸主要集中在本研究萃取的上相，損失了下相綠原酸，所以得率略低于單獨(dú)微波提取。對(duì)比實(shí)驗(yàn)結(jié)果也表明，微波雙水相提取干浸膏中綠原酸的含量明顯提高，純度提高了2.2倍。主要原因是由于分相鹽磷酸氫二鉀的加入，形成了乙醇-磷酸氫二鉀雙水相體系，甘薯葉粉恰好懸浮于兩相之間，易溶于乙醇相的綠原酸提取出后進(jìn)入上相，易溶于水相的多糖等物質(zhì)溶于下相。這樣，提取和分離過程同時(shí)進(jìn)行，對(duì)甘薯葉粗提液中的綠原酸成分起到了一定的純化、富集作用，這與王曉林等[23]研究結(jié)果一致。本研究對(duì)比實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，雖然微波雙水相提取所得干浸膏純度有所提高，但與于華忠等[24]純化方法研究結(jié)果比較總純度不高，原因是雙水相不具有特異性和專一性[25]，甘薯葉中含有其他的一些易溶于乙醇的物質(zhì)進(jìn)入有機(jī)相，而導(dǎo)致綠原酸的純度降低，如何進(jìn)一步純化甘薯葉綠原酸還有待深入研究。本研究的綠原酸得率與其他參考文獻(xiàn)有差異[24]，可能是不同時(shí)期采摘、不同品種甘薯的差異所致[26]。

本研究經(jīng)過新型微波雙水相提取獲得的綠原酸粗提液清除DPPH·的能力強(qiáng)于對(duì)照物綠原酸和VC，與李文娜等[27]研究結(jié)果一致，甘薯葉粗提液的抗氧化活性與綠原酸含量密切相關(guān)。綠原酸粗提液清除DPPH·的能力強(qiáng)于綠原酸，可能是甘薯葉粗提液中黃酮類、酚類等抗氧化物質(zhì)的存在，強(qiáng)化了其清除DPPH·的能力[28]。

4 結(jié)論

對(duì)影響甘薯葉綠原酸得率的多個(gè)單因素進(jìn)行分析，并結(jié)合正交優(yōu)化分析，得到微波協(xié)同雙水相提取甘薯葉綠原酸的最佳工藝條件為：分相鹽磷酸氫二鉀與有機(jī)相乙醇形成乙醇-磷酸氫二鉀雙水相體系，40%乙醇溶液，磷酸氫二鉀質(zhì)量濃度100 mg/mL，液料比100∶1(V/m)，微波功率320 W，微波時(shí)間75 s，此提取條件下甘薯葉綠原酸得率為(3.72±0.036)%。對(duì)照微波法提取，微波協(xié)同雙水相提取得率略小，所得干浸膏綠原酸的純度明顯提高，雙水相體系起到了一定的純化、富集作用，但總純度仍然不高，如何進(jìn)一步提高總純度還有待深入研究。甘薯葉綠原酸粗提液清除DPPH·的能力強(qiáng)于對(duì)照物綠原酸和VC。微波協(xié)同雙水相提取工藝，粗提物純度高，安全便捷，且提取得到的綠原酸粗提物具有較強(qiáng)的抗氧化能力，為甘薯葉的進(jìn)一步資源化開發(fā)利用提供了一定的技術(shù)支撐。