長(zhǎng)白落葉松無(wú)性系抗寒性比較研究

鄭 密 趙國(guó)輝 孫曉陽(yáng) 張秦徽 趙 昕 董利虎 李鳳日 趙曦陽(yáng)*

(1.林木遺傳育種國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，林學(xué)院，東北林業(yè)大學(xué)，哈爾濱 150040； 2.吉林四平林木種子園，四平 136000)

長(zhǎng)白落葉松(Larixolgensis)屬松科(Pinaceae)落葉松屬(LarixSpp.)是我國(guó)東北和內(nèi)蒙古林區(qū)重要的生態(tài)樹(shù)種[1]。其具有樹(shù)干通直、木材優(yōu)良及生長(zhǎng)迅速等優(yōu)點(diǎn)，是東北地區(qū)重要的用材、造紙及森林更新的重要樹(shù)種[2]。我國(guó)對(duì)落葉松遺傳改良已經(jīng)將近50年，研究方向主要從種源選擇[3]到種子園營(yíng)建[4]以及分子標(biāo)記輔助育種[5]等。

溫度是影響植物生長(zhǎng)和分布的重要因子，低溫直接影響植物的生長(zhǎng)和生理代謝[6]。低溫脅迫時(shí)間的長(zhǎng)短也是影響植物發(fā)育的重要因素，隨著脅迫時(shí)間的延長(zhǎng)，植物損傷越重[7]。低溫脅迫會(huì)對(duì)細(xì)胞膜構(gòu)成傷害，導(dǎo)致細(xì)胞膜通透性的改變，細(xì)胞內(nèi)大量的物質(zhì)向外滲透[8]，從而引起相對(duì)電導(dǎo)率的變化，因此，利用相對(duì)電導(dǎo)率可以測(cè)定植物的抗寒性低溫脅迫下，植株相對(duì)電導(dǎo)率越大，抗寒性越差[9]。抗寒性是林木遺傳改良的一個(gè)重要性狀，直接影響著其分布和改良，是抗逆性育種中一個(gè)重要的性狀。自Dexter首次利用低溫下相對(duì)電導(dǎo)率的變化來(lái)測(cè)定植物抗寒性以來(lái)，電導(dǎo)率法已成為抗寒性測(cè)定的最常用的方法之一[10]，目前有很多關(guān)于測(cè)定電導(dǎo)率預(yù)測(cè)抗寒性的報(bào)導(dǎo)，都取得了理想的效果[11]。本研究以四平市林木種子園長(zhǎng)白落葉松58個(gè)無(wú)性系1年生枝條為試驗(yàn)材料，對(duì)其進(jìn)行低溫脅迫處理，利用電導(dǎo)率對(duì)各無(wú)性系進(jìn)行聚類分析，比較不同無(wú)性系的抗寒性強(qiáng)弱，以期為長(zhǎng)白落葉松抗寒無(wú)性系評(píng)價(jià)選擇提供理論基礎(chǔ)。

1 試驗(yàn)材料和方法

1.1 試驗(yàn)地點(diǎn)及材料

試驗(yàn)地點(diǎn)位于吉林省四平市林木種子園(東經(jīng)124°10′、北緯43°05′)，該地點(diǎn)屬于中溫帶濕潤(rùn)季風(fēng)氣候，海拔高度在330 m，土壤為黑棕土，年均降水量572.8 mm，年平均溫度5.9℃，年均無(wú)霜期142 d，年均日照2840 h。試驗(yàn)材料包括58個(gè)28年生長(zhǎng)白落葉松無(wú)性系(L1、L3、L5、L7、L11、L13、L14、L16、L17、L19、L20、L21、L23、L24、L25、L27、L28、L30、L31、L32、L33、L36、L38、L40、L42、L44、L46、L48、L49、L50、L51、L52、L53、L55、L56、L58、L59、L61、L62、L63、L64、L65、L67、L71、L73、L74、L77、L78、L79、L87、L88、L90、L91、L92、L96、L97、L99、L101)。

1.2 試驗(yàn)方法

于2016年11月初(室外溫度-10～0℃)采集各無(wú)性系的1年生枝條，采用完全隨機(jī)試驗(yàn)設(shè)計(jì)，每個(gè)無(wú)性系隨機(jī)選取15株長(zhǎng)勢(shì)相近的樹(shù)，在每個(gè)單株的中上部南側(cè)挑選長(zhǎng)勢(shì)相近、粗細(xì)均勻的當(dāng)年生枝條進(jìn)行取樣(每個(gè)單株取樣10個(gè)長(zhǎng)約10厘米的枝條，每個(gè)無(wú)性系各150個(gè)枝條進(jìn)行混合)，蠟封后用保鮮帶裝好后帶回實(shí)驗(yàn)室，先用自來(lái)水沖洗，再用去離子水沖洗兩遍，用濾紙吸干后放入4℃冰箱保存待用。

1.2.1 時(shí)間與溫度耦合試驗(yàn)

以L1、L36、L59和L90等四個(gè)無(wú)性系為材料，各無(wú)性系的枝條隨機(jī)分成16個(gè)處理組和1個(gè)對(duì)照組，每組6次重復(fù)。無(wú)性系枝條在室溫(20℃)放置1 h后，測(cè)其室溫相對(duì)電導(dǎo)率對(duì)照組。處理組各無(wú)性系枝條分別放入-50℃、-40℃、-30℃和-20℃低溫冰箱中，每個(gè)溫度下分別處理6、8、10和12 h，共16個(gè)處理。處理后將每個(gè)處理的枝條拿出放入4℃冰箱恢復(fù)1 h，測(cè)定其處理相對(duì)電導(dǎo)率。

1.2.258個(gè)無(wú)性系常溫及低溫脅迫下電導(dǎo)率測(cè)定試驗(yàn)

首先根據(jù)1.2.1的方法測(cè)定58個(gè)無(wú)性系的對(duì)照相對(duì)電導(dǎo)率，之后將58個(gè)無(wú)性系的枝條放入-40℃低溫冰箱中，處理12 h，拿出放入4℃冰箱恢復(fù)1 h后，測(cè)定其處理相對(duì)電導(dǎo)率。

1.2.3 相對(duì)電導(dǎo)率測(cè)定方法

將低溫脅迫處理后的枝條剪成0.2～0.3 cm的小段，避開(kāi)芽眼，混合均勻，稱取1 g置于15 mL長(zhǎng)試管中，加入10 mL去離子水，蓋上塞子，置于室溫下12 h，重復(fù)3次，之后用DDS-307A數(shù)字電導(dǎo)儀測(cè)定其初始電導(dǎo)率(D1)，然后蓋上塞子，將試管放入沸水中水浴30 min，取出后冷卻至室溫，再測(cè)定其最終電導(dǎo)率(D2)，利用D1與D2的比值計(jì)算枝條相對(duì)電導(dǎo)率。

1.2.4 統(tǒng)計(jì)分析方法

所有數(shù)據(jù)利用SPSS和EXCELL軟件進(jìn)行分析。其中4個(gè)無(wú)性系溫度與時(shí)間處理方差分析采用線性模型為：

Xijkl=μ+Ai+Bj+Ck+ABij+ACik+BCjk+ABCijk+eijkl

(1)

式中：μ為總體平均值；Ai為無(wú)性系效應(yīng)；Bj為溫度效應(yīng)；Ck為時(shí)間效應(yīng)；ABij為無(wú)性系與溫度交互效應(yīng)；ACik為無(wú)性系與時(shí)間的交互效應(yīng)；BCjk為溫度與時(shí)間的交互效應(yīng)；ABCijk為無(wú)性系、時(shí)間與溫度之間的交互作用；eijkl為環(huán)境誤差。

58個(gè)無(wú)性系之間方差分析采用線性模型為：

Xij=μ+Ai+eij

(2)

式中：μ為總體平均值；Ai為無(wú)性系效應(yīng)；eij為環(huán)境誤差[12]。

根據(jù)續(xù)九如[12]的方法估算無(wú)性系重復(fù)力：

R=1-1/F

(3)

式中：F為方差分析的F值。

2 結(jié)果和分析

2.1 不同時(shí)間及溫度處理?xiàng)l件下4個(gè)無(wú)性系的相對(duì)電導(dǎo)率方差分析

4個(gè)無(wú)性系(L1、L36、L59和L90)處理組相對(duì)電導(dǎo)率數(shù)據(jù)反正弦轉(zhuǎn)換處理后進(jìn)行方差分析，結(jié)果見(jiàn)表1，所有變異來(lái)源的相對(duì)電導(dǎo)率差異均達(dá)極顯著水平(P<0.01)。

表1不同溫度和時(shí)間處理下4個(gè)無(wú)性系相對(duì)電導(dǎo)率的方差分析

Table1ANOVAanalysisofrelativeelectrolyticleakageof4clonesunderdifferenttemperatureandtimetreatment

性狀TraitsSSdfMSF無(wú)性系Clone0.16530.055515.775**溫度Temperature0.71730.2392242.357**時(shí)間Time0.14730.049459.487**無(wú)性系×溫度Clone×Temperature0.06990.00871.627**無(wú)性系×?xí)r間Clone×Time0.01190.00111.296**溫度×?xí)r間Temperature×Time0.04790.00549.478**無(wú)性系×溫度×?xí)r間Clone×Temperature×Time0.051270.00217.773**誤差Error0.0141280.000總計(jì)In all58.403191

注：**代表方差分析檢驗(yàn)差異達(dá)極顯著水平(P<0.01)。

Note:**indicated significant level of ANOVA test.

2.2 不同溫度和時(shí)間處理下4個(gè)無(wú)性系相對(duì)電導(dǎo)率值

在相同的脅迫時(shí)間下，隨著溫度的降低，各無(wú)性系處理相對(duì)電導(dǎo)率均逐漸升高(表2)；在同一溫度脅迫下，隨著脅迫時(shí)間的延長(zhǎng)，各無(wú)性系處理相對(duì)電導(dǎo)率的變化趨勢(shì)不盡相同。在-20℃低溫脅迫下，隨著時(shí)間的延長(zhǎng)(6～12 h)，各無(wú)性系處理相對(duì)電導(dǎo)率均呈現(xiàn)逐步升高的趨勢(shì)，表明在該溫度條件下，低溫脅迫時(shí)間越長(zhǎng)，對(duì)細(xì)胞膜造成的傷害越大；而在-30℃和-40℃的低溫脅迫下，雖然各無(wú)性系相對(duì)電導(dǎo)率總體仍是增大的趨勢(shì)，但部分無(wú)性系(-30℃下無(wú)性系L36，-40℃下無(wú)性系L59和L90)表現(xiàn)出在處理相對(duì)電導(dǎo)率增大的過(guò)程中出現(xiàn)小幅度減小的規(guī)律；當(dāng)溫度降低到-50℃時(shí)，在脅迫時(shí)間8～10 h，無(wú)性系L36、L59和L90的處理相對(duì)電導(dǎo)率在上升后均出現(xiàn)了急劇的下降，只有無(wú)性系L1的處理相對(duì)電導(dǎo)率未出現(xiàn)下降，反而隨脅迫時(shí)間延長(zhǎng)逐漸上升。

2.3 室溫及低溫脅迫下各無(wú)性系相對(duì)電導(dǎo)率方差分析

利用T檢驗(yàn)分析室溫和處理?xiàng)l件下58個(gè)無(wú)性系相對(duì)電導(dǎo)率，結(jié)果表明差異達(dá)顯著水平(P<0.05)，進(jìn)一步對(duì)58個(gè)無(wú)性系間室溫和低溫脅迫后所測(cè)的相對(duì)電導(dǎo)率進(jìn)行方差分析(表3)，在室溫和處理下，無(wú)性系間的相對(duì)電導(dǎo)率均存在極顯著的差異。從重復(fù)力來(lái)看，室溫和處理?xiàng)l件下，無(wú)性系電導(dǎo)率重復(fù)力均較高，分別達(dá)到0.95和0.98。

表2不同溫度和時(shí)間處理下各無(wú)性系的處理相對(duì)電導(dǎo)率

Table2Averagerelativeelectrolyticleakageofdifferentcloneunderdifferenttemperatureandtimetreatment

溫度Temperature無(wú)性系Clone時(shí)間Time處理電導(dǎo)率Average conductivity-50℃L1L36L59L90653.00±2.54c861.92±0.06b1064.20±0.84ab1267.00±1.87a658.67±1.41c875.81±1.75a1072.09±1.13b1276.41±1.21a663.47±1.51d882.17±0.49a1072.43±4.56c1279.06±1.68a659.94±1.39c871.31±0.27b1061.57±1.27c1275.05±0.28a-40℃L1L36L59L90653.07±0.14c857.32±1.24b1057.84±0.33b1262.28±0.24a660.25±0.70c860.35±0.97c1073.01±2.05b1276.04±1.40a657.42±0.78c862.43±0.30b1059.42±0.56bc1267.87±0.17a658.66±1.21a859.95±0.88a1055.62±0.43b1259.71±1.52a-30℃L1L36L59L90644.11±0.82b845.31±0.37ab1046.29±0.28a1248.41±2.58a656.13±1.20b852.44±0.99c1056.50±0.46b1265.94±0.58a653.60±1.29c854.47±0.25bc1057.28±1.17b1260.78±0.74a651.14±0.72c855.40±1.39ab1056.62±0.26a1258.57±1.45a-20℃L1L36L59L90642.01±0.26b842.34±0.50ab1045.20±0.37a1246.70±0.41a646.36±1.38b847.20±1.82b1048.06±0.40b1251.19±1.28a648.66±0.86b850.74±0.90ab1052.25±1.62a1252.77±0.94a644.97±0.65c846.10±0.33c1049.59±0.71b1252.70±1.26a室溫條件下Under indoor temperatureL1—27.51±6.76L36—29.00±1.63L59—29.49±0.82L90—34.31±1.46

表3室溫及低溫脅迫下無(wú)性系間電導(dǎo)率方差分析

Table3ANOVAofconductivityamonydifferentcloneunderindoororlowtemperaturestress

電導(dǎo)率Conductivity變異來(lái)源Variance sourceSSdfMSFR室溫條件下Under indoor temperature 無(wú)性系Clone4561.845780.0319.53**0.95低溫脅迫下Under Low temperature stress無(wú)性系Clone13323.7557233.7543.44**0.98

2.4 室溫及處理?xiàng)l件下各無(wú)性系相對(duì)電導(dǎo)率均值

各無(wú)性系室溫和-40℃處理?xiàng)l件下的平均相對(duì)電導(dǎo)率見(jiàn)表4，低溫脅迫下各無(wú)性系相對(duì)電導(dǎo)率總體均值為61.51%，為室溫條件下(28.58%)的2.15倍；在室溫和低溫脅迫下，相對(duì)電導(dǎo)率最大的無(wú)性系均為L(zhǎng)55，其值分別為37.89%和76.58%，比總體平均值分別高32.58%和24.50%，比最小值L40(16.79%和38.73%)分別高125.67%和97.73%；不同無(wú)性系在低溫脅迫下和室溫的平均相對(duì)電導(dǎo)率差值大小變化也不同，其中無(wú)性系L36的差值最大(47.04%)為最小的為無(wú)性系L40(21.95%)的2.14倍。

表4 室溫及低溫脅迫下各無(wú)性系相對(duì)電導(dǎo)率均值

注：均值單位為%，下同。

Note:The unit of average relative conductivity were %,the same as below.

2.5 聚類分析

以低溫(-40℃、12 h)和室溫條件下各無(wú)性系相對(duì)電導(dǎo)率的差值為指標(biāo)進(jìn)行聚類分析，采用歐氏距離聚類法，在遺傳距離為8左右時(shí)，58個(gè)無(wú)性系被聚為3類(圖1)。第一類為L(zhǎng)1、L3、L7等37個(gè)無(wú)性系，第二類為L(zhǎng)5、L16、L21等9個(gè)無(wú)性系，第三類為L(zhǎng)25、L30、L36等13個(gè)無(wú)性系。三類無(wú)性系相對(duì)電導(dǎo)率差值的總體均值分別為32.53%、26.16%和38.73%，低溫(-40℃、12 h)脅迫下三類無(wú)性系的相對(duì)電導(dǎo)率總體均值分別為60.42%、49.75%和72.68%，室溫條件下三類無(wú)性系的相對(duì)電導(dǎo)率總體均值分別為27.89%、23.59%和33.95%。相比第一類和第三類無(wú)性系而言，第二類無(wú)性系在室溫和-40℃、12 h處理下的相對(duì)電導(dǎo)率均較低，表明其抵抗低溫脅迫的能力較其他無(wú)性系強(qiáng)。

圖1 各無(wú)性系相對(duì)電導(dǎo)率差值聚類分析Fig.1 Cluster analysis of the difference of relative electrolytic leakage of different clone

3 討論

植物相對(duì)電導(dǎo)率的大小能反映其細(xì)胞膜受損的程度，可以作為抗寒性強(qiáng)弱的測(cè)定指標(biāo)[13～14]。不同溫度和時(shí)間處理下，各無(wú)性系間相對(duì)電導(dǎo)率存在極顯著差異，且隨著低溫脅迫時(shí)間的延長(zhǎng)或溫度的降低，各無(wú)性系相對(duì)電導(dǎo)率均呈現(xiàn)逐漸增大趨勢(shì)，表明細(xì)胞膜損傷加劇，這與烏鳳章[15]等對(duì)黑松(PinusthunbergiiParl.)和龔月樺等[16]對(duì)奧地利黑松(Pinusnigravar.austriaca)、花旗松(Pseudotsugamenziesiivar.glauca)的研究結(jié)果類似。在-30℃和-40℃的低溫脅迫下，雖然各無(wú)性系相對(duì)電導(dǎo)率總體仍是增大的趨勢(shì)，但部分無(wú)性系(-30℃下無(wú)性系L36，-40℃下無(wú)性系L59和L90)表現(xiàn)出在相對(duì)電導(dǎo)率增大的過(guò)程中出現(xiàn)小幅度減小的規(guī)律，表明其呈現(xiàn)不同程度的自我修復(fù)能力，部分無(wú)性系相對(duì)電導(dǎo)率在增長(zhǎng)過(guò)程中會(huì)出現(xiàn)先降低再增長(zhǎng)的現(xiàn)象，這可能與細(xì)胞的自我修復(fù)能力以及這種能力不足以抵抗低溫脅迫對(duì)細(xì)胞膜造成的損傷有關(guān)[17]，具體的生理代謝機(jī)制有待于今后的進(jìn)一步研究。在不同低溫持續(xù)脅迫下，各無(wú)性系相對(duì)電導(dǎo)率隨著溫度降低逐漸增大，當(dāng)溫度降低到-40℃，持續(xù)10 h低溫脅迫處理時(shí)，絕大部分無(wú)性系相對(duì)電導(dǎo)率出現(xiàn)降低趨勢(shì)，再一次體現(xiàn)細(xì)胞膜的自我恢復(fù)能力，但當(dāng)時(shí)間持續(xù)到12 h時(shí)，相對(duì)電導(dǎo)率逐漸上升。在-40℃、12 h處理下，各無(wú)性系的相對(duì)電導(dǎo)率變化范圍在59.71%～76.04%，相比室溫和其他處理而言，更接近半致死溫度下的相對(duì)電導(dǎo)率[18]，因此以-40℃、12 h處理對(duì)58個(gè)無(wú)性系進(jìn)行脅迫試驗(yàn)。

抗寒性較強(qiáng)的無(wú)性系，其細(xì)胞膜受損程度低，自我修復(fù)能力強(qiáng)，而抗寒性差的無(wú)性系，其細(xì)胞膜面對(duì)低溫脅迫時(shí)，自我修復(fù)能力差，細(xì)胞膜破壞嚴(yán)重[19]。本研究中利用相同低溫脅迫(-40℃、12 h)條件處理不同無(wú)性系，結(jié)果表明低溫脅迫下不同無(wú)性系之間相對(duì)電導(dǎo)率呈極顯著差異水平，說(shuō)明不同基因型具有不同的抗寒性，進(jìn)一步表明對(duì)不同無(wú)性系進(jìn)行評(píng)價(jià)選擇具有重要意義。聚類分析是基于距離和樣品間的相似度，將研究對(duì)象按多個(gè)方面的特征進(jìn)行綜合分類的一種統(tǒng)計(jì)方法[20]。本研究中根據(jù)各無(wú)性系在-40℃、12 h處理和室溫條件下相對(duì)電導(dǎo)率差值，運(yùn)用歐氏距離聚類分析法，在歐氏距離為8左右時(shí)，將各無(wú)性系聚為三類，其中第二類無(wú)性系(L5、L16、L21、L23、L27、L40、L73、L78和L90)相對(duì)電導(dǎo)率差值較小，在-40℃、12 h低溫脅迫下的總體平均相對(duì)電導(dǎo)率為49.75%，其抗寒性較強(qiáng)，可作為抗寒性育種中優(yōu)良無(wú)性系的選擇材料。尤其無(wú)性系L90，在室溫條件下電導(dǎo)率較高，但處理后電導(dǎo)率上升較小，表現(xiàn)較強(qiáng)的預(yù)抗性及抗寒性[21]。

隨著林木育種進(jìn)程的推進(jìn)以及不同育種目標(biāo)的需求，林木抗寒性性狀的選擇仍具有重要的育種意義[22]。本研究中對(duì)58個(gè)無(wú)性系進(jìn)行持續(xù)低溫脅迫處理和聚類分析，初步篩選出抗寒性較強(qiáng)的9個(gè)無(wú)性系(L5、L16、L21、L23、L27、L40、L73、L78和L90)，這對(duì)于長(zhǎng)白落葉松抗寒性研究和優(yōu)良無(wú)性系綜合評(píng)價(jià)選擇具有重要意義，為今后長(zhǎng)白落葉松抗逆性育種研究提供理論基礎(chǔ)。