基于SCoT分子標記的裸果木遺傳多樣性分析

狄林楠 李新蓉 宋 楠

(新疆農(nóng)業(yè)大學草業(yè)與環(huán)境學科學學院，烏魯木齊 830052)

遺傳多樣性作為生物多樣性的重要組成部分，是物種多樣性和生態(tài)系統(tǒng)多樣性的基礎，是生物物種在長期進化過程中積累起來的遺傳變異，是其生存適應和進化的前提，遺傳多樣性的喪失將對物種生存帶來不利影響[1～2]。對珍稀瀕危植物的遺傳多樣性研究不僅有助于了解物種的進化歷史和適應潛力，同時對其保護和管理也至關(guān)重要[3～4]。近年來，隨著DNA分子標記技術(shù)的不斷完善和發(fā)展，包括ISSR、RAPD等DNA分子標記正廣泛地應用于珍稀瀕危植物遺傳多樣性的研究[5～7]。目標起始密碼子多態(tài)性(SCoT,start codon targeted polymorphism)標記是Collard和Mackill[8]基于植物基因中的ATG翻譯起始位點側(cè)翼序列的保守性而新開發(fā)的一種目的基因分子標記。與ISSR標記、RAPD標記類似亦為單引物，不同的是SCoT分子標記是一種目的基因分子標記，其本身可能是目的基因的一部分或與目的基因緊密聯(lián)鎖；另外與RAPD標記相比較，其使用了較長的引物長度，理論上比RAPD標記重復性好；同時還具有引物設計簡單、操作簡單、成本低廉和多態(tài)性高等特點[8～10]。目前已成功在評估遺傳多樣性與遺傳結(jié)構(gòu)、種質(zhì)鑒定與指紋圖譜構(gòu)建等方面得到運用[11～14]。

裸果木(Gymnocarposprzewalskii)為石竹科(Caryophyllaceae)裸果木屬(Gymnocarpos)植物，亞灌木，是白堊紀——第三紀古老荒漠的殘余成分，是構(gòu)成石質(zhì)荒漠植被重要建群物種之一，對研究中國西北荒漠的形成、氣候變化以及旱生植物區(qū)系成分的起源有較重要的科學價值[15]。裸果木在國內(nèi)僅分布在甘肅、內(nèi)蒙古、寧夏和新疆等省區(qū)，另有少量分布在蒙古，在新疆主要分布在哈密盆地和塔里木盆地[16～17]。裸果木具兩性花，在盛花期呈現(xiàn)出“集中大量”的開花模式，并有少量花蜜分泌且有濃烈氣味，繁育系統(tǒng)屬于以異交為主、部分自交親和且需要傳粉者的混合繁育系統(tǒng)類型[18～19]。由于裸果木生存條件惡劣，過度樵采和駱駝啃食等人類活動的干擾和破壞，其種群處于不斷衰退中[20]。王靜等[21]對裸果木RAPD反應體系優(yōu)化進行了研究，Ma等[22]運用葉綠體DNA和徐振朋等[23]用ISSR標記對裸果木種群遺傳多樣性進行了研究，但關(guān)于裸果木遺傳多樣性和遺傳結(jié)構(gòu)及其影響因素還有所不足，本文運用SCoT分子標記技術(shù)對新疆裸果木分布集中的7個自然種群遺傳多樣性進行分析，探討裸果木種群遺傳多樣性和遺傳結(jié)構(gòu)及其影響因素，為進一步保護和利用裸果木提供基礎資料。

1 材料與方法

1.1 野外調(diào)查和采樣

2015年5月在新疆裸果木分布集中的7個自然種群采集樣品，材料來源見表1和圖1。選取裸果木頂端幼嫩的葉片放入裝有硅膠的自封袋中干燥，每個自封袋中硅膠與裸果木嫩葉的比例不小于100∶1，對每袋樣本分別進行標記。

表1裸果木自然種群的地理位置和樣本大小

Table1LocationsamplesizeofG.przewalskiipopulations

種群Population經(jīng)度Latitude(E)緯度Longitude(N)海拔Altitude(m)樣本數(shù)Sample number輪臺Luntai(LT)84°24'41°59'107730烏恰Wuqia(WQ)75°01'39°39'213430拜城Baicheng(BC)81°50'41°52'140839疏附Shufu(SF)75°44'39°19'13526庫車Kuqa(KC)82°41'41°55'146536哈密廟爾溝Hami Miaoergou(HM)93°53'42°52'97830哈密三道嶺Hami Sandaoling(HS)92°33'43°15'132930

圖1 裸果木采樣分布圖Fig.1 Geographic location of G.przewalskii

1.2 研究方法

1.2.1 DNA的提取

采用改良CTAB法提取裸果木基因組DNA，所得的DNA用紫外分光光度計(NanoDrop ND1000型，美國Thermo Scientific公司)和1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測其濃度和質(zhì)量，并于-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 引物篩選

SCoT引物參照Collard和Mackill[8]、Luo等人[11]公布的引物序列，由北京鼎國昌盛生物技術(shù)有限責任公司合成，引物篩選過程如下：

(1)初篩：選取供試樣品中7個種群各一個樣品所提取的DNA組成混合模板，分別對80條引物組合進行篩選，以期得到適合裸果木遺傳多樣性分析的引物(此次篩選結(jié)果篩選出28條引物)。

(2)復篩：利用篩選出的引物分別對個體進行篩選，選出最適合于此樣品的引物。利用最終確定的引物(表2)對裸果木所有個體進行PCR擴增。

表2 SCoT引物信息表

1.2.3 SCoT-PCR擴增及檢測

SCoT-PCR反應體系：25 μL的反應體系中包含有l(wèi) μL模板DNA(50 ng)，1 μL引物(10 μmol·L-1)，0.3 μL Taq DNA聚合酶(2.5 U·μL-1)，0.4 μL dNTPs(10 mmol·L-1)，2.5 μL 10×Taq Buffer(15 mmol·L-1MgCl2)，其余部分由ddH2O補足。

PCR反應程序為：94℃預變性5 min，94℃變性5 s，退火15 s，72℃延伸50 s反應35個循環(huán)，72℃延伸7 min，4℃保存。

PCR擴增產(chǎn)物檢測：擴增產(chǎn)物與4 μL上樣緩沖液混合后在6%的非變性聚丙烯酰胺凝膠上電泳1 h分離，利用銀染法進行染色，照相記錄。

1.2.4 數(shù)據(jù)處理

根據(jù)每條引物擴增產(chǎn)物在非變性聚丙烯酰胺凝膠中遷移率的不同，對電泳結(jié)果進行統(tǒng)計，擴增陽性(有條帶出現(xiàn))賦值為1，擴增陰性(無條帶出現(xiàn))賦值為0，依據(jù)條帶有無統(tǒng)計得到所有位點的二元矩陣輸入計算機。應用Popgene32計算多態(tài)位點數(shù)(P)、多態(tài)位點百分率(PPB)、觀察等位基因數(shù)(na)、有效等位基因數(shù)(ne)、Nei’s遺傳多樣性指數(shù)(H)、Shannon’s信息多樣性指數(shù)(I)、種群總的基因多樣性(Ht)、種群內(nèi)的基因多樣性(Hs)、遺傳分化系數(shù)(Gst)、Nei的遺傳一致度和遺傳距離，根據(jù)Ht和Hs計算種群間的基因多樣性和種群內(nèi)遺傳分化所占比例，種群間基因流(Nm)由Nm=(1-Gst)/4Gst計算。另外運用SPSS20.0軟件非參數(shù)檢驗對H和I進行顯著性檢驗，檢驗各種群間遺傳多樣性是否存在差異。

采用STRUCTURE2.3.4軟件分析裸果木的遺傳結(jié)構(gòu)，將參數(shù)“Length of Burnin period”和“Number of MCMC Reps after Burnin”均設為10 000次，K值設為2～7，重復次數(shù)為10。將運算結(jié)果提交到在線工具Structure Harvester(http://taylor0.biology.ucla.edu/struct_harvest/)以判斷群體的最佳K值(△K值)，運用CLUMPP1.1.2重復抽樣分析最佳K值，再利用Distruct 1.1軟件作圖。

運用NTSYS 2.10e軟件對裸果木種群遺傳距離和地理距離的相關(guān)性進行Mantel檢驗。此外對201份不同自然種群裸果木材料進行主坐標分析(PCoA,principal coordinates analysis)，建立平面散點圖。

2 結(jié)果

2.1 裸果木種群的遺傳多樣性

12條引物對7個種群的201個個體共擴增出145個位點，擴增得到的DNA片段長度大多介于100～1 500 bp，每條引物擴增的位點在10～17個。由表3可知，裸果木物種水平的多態(tài)位點數(shù)為141個，多態(tài)位點百分率為97.24%；而種群水平的多態(tài)位點數(shù)在54～131，多態(tài)位點百分率在37.24%～90.34%，疏附(SF)種群的多態(tài)位點百分率最低為37.24%，而哈密廟爾溝(HM)種群的多態(tài)位點百分率最高為90.34%，種群水平平均多態(tài)位點百分率為76.45%。

用Popgene32對不同裸果木自然種群的遺傳多樣性進行統(tǒng)計分析(表3)，裸果木種群觀察等位基因數(shù)在1.372 4～1.903 4，有效等位基因數(shù)在1.252 9～1.484 2，Nei’s遺傳多樣性指數(shù)在0.145 6～0.285 1，Shannon’s信息多樣性指數(shù)在0.214 4～0.432 0，其中哈密廟爾溝(HM)裸果木種群在幾個遺傳多樣性指標均高于其它裸果木種群，疏附(SF)種群最低。整體而言，裸果木物種水平上的遺傳多樣性相對豐富，觀察等位基因數(shù)、有效等位基因數(shù)、Nei’s遺傳多樣性指數(shù)和Shannon’s信息多樣性指數(shù)分別為1.972 4、1.436 9、0.263 8和0.408 1；而種群水平上的遺傳多樣性相對較低，幾個遺傳多樣性指標平均值分別為1.764 5、1.350 4、0.213 7和0.331 6。對裸果木種群的Nei’s遺傳多樣性指數(shù)和Shannon’s信息多樣性指數(shù)的顯著性檢驗結(jié)果表明：哈密三道嶺(HS)分別與哈密廟爾溝(HM)、烏恰(WQ)種群的Nei’s遺傳多樣性指數(shù)和Shannon’s信息多樣性指數(shù)差異不顯著(P>0.05)，與其它種群存在顯著差異(P<0.05)；疏附(SF)與輪臺(LT)、拜城(BC)、庫車(KC)種群的Nei’s遺傳多樣性指數(shù)差異不顯著(P>0.05)，與其它種群存在顯著差異(P<0.05)；疏附(SF)與庫車(KC)種群的Shannon’s信息多樣性指數(shù)差異不顯著(P>0.05)，與其它種群的差異存在顯著差異(P<0.05)。

表3 裸果木自然種群的遺傳多樣性指標

注：同列不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)P.多態(tài)位點數(shù)；PPB.多態(tài)位點百分率；na.觀測等位基因；ne.有效等位基因數(shù)；H. Nei’s遺傳多樣性指數(shù)；I. Shannon’s信息多樣性指數(shù)

Note:The data with different little letters in same column show significant difference(P<0.05)P. Number of polymorphic loci;PPB. Percentage of polymorphic bands;na. Observed number of alleles;ne. Gene diversity in subdivided populations;H. Nei’s gene diversity;I. Shannon’s information index

2.2 裸果木種群的遺傳結(jié)構(gòu)

裸果木總的基因多樣性(Ht)為0.261 8，種群內(nèi)的基因多樣性(Hs)占81.61%，為0.213 7，種群間遺傳分化系數(shù)(Gst)為0.183 9，表明種群間的基因多樣性(Ht-Hs)占18.39%，為0.048 1，基于遺傳分化系數(shù)而得出的基因流(Nm)為1.109 4。從表4可看出，裸果木各種群間的遺傳一致度在0.887 9～0.972 7，庫車(KC)和哈密三道嶺(HS)種群的遺傳一致度最小，哈密三道嶺(HS)與哈密廟爾溝(HM)種群的遺傳一致度最大；裸果木種群間的遺傳距離在0.027 7～0.118 9，其中庫車(KC)和哈密三道嶺(HS)種群的遺傳距離最遠，哈密三道嶺(HS)與哈密廟爾溝(HM)種群的遺傳距離最近。Mantel檢驗結(jié)果表明裸果木種群遺傳距離與地理距離之間不存在顯著相關(guān)性(r=0.239 8，P>0.05)。

表4裸果木自然種群間的遺傳一致度和遺傳距離

Table4GeneticidentityandgeneticdistanceofG.przewalskiipopulations

LTWQBCSFKCHMHSLT****0.96980.96280.89180.90350.93320.9246WQ0.0306****0.97060.91990.92950.94560.9333BC0.03790.0298****0.91310.93050.94380.9318SF0.11460.08350.0909****0.96540.90210.8901KC0.10150.07310.07200.0352****0.90020.8879HM0.06920.05600.05790.10300.1051****0.9727HS0.07840.06900.07060.11640.11890.0277****

注:對角線上方為Nei’s 遺傳一致度，對角線下方為遺傳距離。

Note:Nei’s genetic identity(above diagonal) and genetic distance(below diagonal).

為了探討裸果木個體間的親緣關(guān)系，根據(jù)SCoT標記所獲得的結(jié)果，分別進行主坐標分析和STRUCTURE分析。主坐標分析結(jié)果見圖2，第1、2主成分分別解釋了12.4704%和7.2422%的樣本相關(guān)性，201株裸果木大致可以被分為3大組：第一組以哈密兩個種群為主，第二組以烏恰(WQ)、輪臺(LT)和拜城(BC)種群為主，第三組以庫車(KC)、疏附(SF)種群為主。STRUCTURE分析表明，當K=5時，ΔK散點曲線出現(xiàn)最大值，出現(xiàn)明顯拐點，說明201株裸果木被分為5個組群(圖3)。裸果木個體歸屬于各組群的結(jié)果顯示：組群1(藍色)以哈密兩個種群為主，組群2(綠色)以輪臺(LT)和烏恰(WQ)種群為主，組群3(黃色)以烏恰(WQ)和拜城(BC)為主，組群4(粉紅色)以疏附(SF)和庫車(KC)為主，組群5(紅色)包含庫車(KC)、哈密廟爾溝(HM)和哈密三道嶺(HS)種群部分裸果木個體(圖4)。

圖2 裸果木201株個體的主坐標分析圖Fig.2 Principal coordinate analysis for 201 individuals of G.przewalskii

圖3 Delta K(ΔK)值隨組群數(shù)的變化圖Fig.3 Plot of the Delta K(ΔK) on the number of population genetic clusters

3 討論

3.1 裸果木的遺傳多樣性

在物種水平上，裸果木多態(tài)位點百分率(PPB)為97.24%，Nei’s遺傳多樣性指數(shù)(H)和Shannon’s信息多樣性指數(shù)(I)分別為0.263 8和0.408 1，明顯高于我國干旱地區(qū)孑遺植物蒙古沙冬青(Ammopiptanthusmongolicus，I=0.102 6)和新疆沙冬青(A.nanus，I=0.070)[24]，與蒙古扁桃(Amygdalusmongolica)和長葉紅砂(Reaumuriatrigyna)[5,25]等曾在第三紀或更早廣泛分布的孑遺植物相同，具有較高的遺傳多樣性。一些研究表明物種遺傳多樣性的維持與其繁育系統(tǒng)、種子傳播機制、生活型、地理分布和系統(tǒng)進化歷史有關(guān)，其中繁育系統(tǒng)和系統(tǒng)進化歷史是影響物種遺傳多樣性的重要因素[26～27]。裸果木作為第三紀孑遺植物，較長的進化歷史所積累的突變，導致其具有豐富的遺傳基礎，由于其受第四紀冰川作用的影響，現(xiàn)有幸存種群可能保留和繼承了了祖先總體豐富的遺傳基礎，使其具有較高的遺傳多樣性。在我們前期研究中，發(fā)現(xiàn)裸果木具有以異交為主，部分自交親和，需要傳粉者的混合繁育系統(tǒng)類型[18]， 可以通過有性重組產(chǎn)生新的基因型，從而維持其種群的遺傳多樣性。在種群水平上，裸果木自然種群的遺傳多樣性指標變化范圍較大，具有較高的遺傳多樣性，Nei’s遺傳多樣性指數(shù)和Shannon’s信息多樣性指數(shù)的顯著性分析表明，各種群間遺傳多樣性有較大差異(表3)，這可能與種群大小和人為干擾等因素有關(guān)，如疏附種群遺傳多樣性較低，可能是由于規(guī)模較小，部分植株又因修路而被砍伐，所剩個體數(shù)量較少，容易引起種群內(nèi)近交和遺傳漂變的發(fā)生而導致遺傳多樣性的喪失。

圖4 STRUCTURE對裸果木遺傳結(jié)構(gòu)的分析結(jié)果Fig.4 Results of genetic structure analyses of G.przewalskii by STRUCTURE

3.2 裸果木的遺傳結(jié)構(gòu)

裸果木遺傳分化系數(shù)為0.183 9，說明其遺傳變異主要來自種群內(nèi)，種群間存在一定程度的分化。裸果木的基因流為1.109 4，表明裸果木種群間存在著一定程度的基因交流，可能是因為異交為主的繁育系統(tǒng)促進了種群個體間的基因交流，這有利于減小其因遺傳漂變引起的種群間的分化。一些學者提出，種群間沒有完全的地理隔離或空間隔離，存在一定程度基因流[28～29]。本文中裸果木種群地理距離均較遠，其中哈密廟爾溝(HM)和哈密三道嶺(HS)種群分布在天山東段的哈密盆地，其余種群沿天山南麓不連續(xù)地分布在塔里木盆地西部和北部。我們猜測裸果木種群間存在一定的基因交流，但不完全隔離導致其種群間產(chǎn)生了一定程度的分化。

運用主坐標分析(PCoA)和STRUCTURE分析對裸果木個體聚類分析存在一定差異，但總體上結(jié)果是一致的。這可能是因為主坐標分析(PCoA)是根據(jù)遺傳相似系數(shù)進行遺傳聚類，而STRUCTURE分析是基于模型，以似然值或貝葉斯方法進行群體聚類[30～31]。有關(guān)對同種植物采用不同方法進行遺傳結(jié)構(gòu)分析而結(jié)果不一致的研究也有報道[7,32]。兩種聚類分析方法均表明地理距離近的種群不一定優(yōu)先聚在一起，Mantel檢驗的結(jié)果表明裸果木種群地理距離與遺傳距離不存在顯著相關(guān)性也證明了這一點。這說明除地理隔離外，群體間現(xiàn)有的遺傳結(jié)構(gòu)還可能與裸果木的進化歷史和各種群的人為破壞程度等因素有關(guān)。有研究表明，第四紀冰期和間冰期氣候變化反復導致植物在冰期退縮到生境適宜的避難所，冰期后又從避難所遷移擴散到其他地區(qū)[33～34]，隨著第四紀冰期后氣候變暖，拜城(BC)、輪臺(LT)和庫車(KC)種群可能分別由位于塔里木盆地避難所的烏恰(WQ)和疏附(SF)種群快速擴張形成的。人為干擾也可能會對物種的遺傳分化造成一定影響[35]，在野外調(diào)查中發(fā)現(xiàn)高頻繁的人為活動造成部分裸果木種群逐漸縮小，如疏附(SF)種群由于修路導致部分植株被砍伐，可能會降低種群間基因交流強度，加劇遺傳分化程度。林樂靜等[36]研究認為修路和開荒毀林導致伯樂樹(Bretschneiderasinensis)部分種群數(shù)量和規(guī)模減少，可能會加劇種群遺傳分化，李龍梅等[37]發(fā)現(xiàn)馬褂木(Liriodendronchinense)東部組遺傳分化較高，這可能與人為活動頻繁致使群體規(guī)模劇減有關(guān)。

3.3 裸果木的保護

裸果木遭樵采和駱駝啃食嚴重，暴雨和山洪等自然災害也會對其產(chǎn)生一定程度的影響，造成裸果木個體數(shù)量日趨減少。在前期研究中發(fā)現(xiàn)裸果木結(jié)實率低，傳粉媒介和花粉傳播受到限制。裸果木目前雖具有較高的遺傳多樣性，但隨著裸果木有性生殖持續(xù)受到限制以及個體數(shù)量進一步減少，其遺傳多樣性很可能會逐漸降低。根據(jù)本文的研究結(jié)果，建議制定保護措施如下：第一，就地保護，當?shù)卣梢栽诼愎具z傳多樣性高和分布集中的地區(qū)(如哈密廟爾溝、哈密三道嶺和烏恰)建立自然保護區(qū)，嚴禁亂墾濫伐，就地保護裸果木；第二，遷地保護，在進行遷地保護的過程中應考慮近交衰退和遠交衰退的影響[38]，應根據(jù)種群聚類結(jié)果，有選擇性地從不同自然種群引種(如從疏附引種到哈密兩個種群)，人為提高種群的基因交流，增強物種進化潛力；第三，在花期對傳粉昆蟲訪問較少的裸果木個體補授花粉，以提高其有性生殖的能力，從而提高其種群內(nèi)的遺傳多樣性。